Abstract :
[en] The widespread use of antibiotics has caused bacteria to become drug resistant. Efforts have been done by many research groups to identify new molecules as inhibitors or inactivators of resistant proteins like Penicillin Binding Proteins (PBPs) or to find new targets which allow putting peptidoglycan (PG) biosynthesis under control. The aim of this work is to develop a new labeling method for PG allowing to identify novel antibiotics and worthy target for inhibition. In Escherichia coli, meso-diaminopimelic acid (A2pm) is a key molecule for reticulation of PG. During this work, we synthesized meso-lanthionine, the monosulfur analogue of meso A2pm, and some of its derivatives. As these compounds are susceptible to enter PG biosynthesis via MurE enzymatic addition onto UDP (S) Ala γ (R) Glu, their use in a new labeling method has been investigated. Another approach was the introduction of labeled lanthionines in PG via the recycling pathway by replacement of the natural tripeptide (S) Ala γ (R)-Glu-meso-A2pm with tripeptide analogues containing modified lanthionines. We have developed a new stereoselective synthesis of the three lanthionine diastereomers (meso-Lan, (R,R)-Lan and (S,S)-Lan) and of an α-benzylated analogue. Good yields at the gram scale and excellent diastereomeric excesses (>99%), without any enrichment step, were obtained in aqueous solution. Biological experiments showed the incorporation of meso-Lan and (R,R)-Lan into PG. Upon this results, [35S]lanthionine diastereomers could be used to study the biosynthesis of PG and its turnover in relation to cell growth and division. Unfortunately, the α-benzylated lanthionine was not incorporated. This result indicates that the introduction of lanthionines with a substituted aromatic group at this position is not feasible via the reaction catalysed by MurE. We have also developed a synthesis of protected lanthionines bearing an α-alkyl group useful for the preparation of PG building block analogues. An enantiomeric excess of 97% was obtained for the alkylation of an oxazoline precursor. An SN2 reaction with a cysteine on the β carbon of cyclic sulfamidate precursors was highly successful, despite the sterically crowded α-carbon. In this way, we have obtained several protected α-alkyl lanthionines. These products are promising building blocks for peptide synthesis. In this report, we also describe a diastereoselective synthesis of α-substituted tripeptides. These compounds, containing a fluorescent tag or a photoactivatable group situated on an α carbon, could potentially be used to study PG biosynthesis. We have obtained chiral α alkyl sulfamidates with enantiomeric excess of 89 97%. Those sulfamidates are excellent electrophiles with cysteine to provide lanthionines. The lanthionines were then readily converted into tripeptides (S)-Ala-γ-(R)-Glu-(R,S/R,R)-α-benzyl-lanthionine and phenylazido analogues in a one pot reaction. Those tripeptides were substrates of Mpl in vitro. We did not observe any incorporation of these tripeptides in the PG of E. coli.
[fr] L'utilisation généralisée des antibiotiques a rendu beaucoup de bactéries résistantes à ces médicaments. De nombreux groupes de recherches se sont intéressés à ce problème. Il est donc primordial d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices de protéines résistantes telles les Penicillin Binding Proteins (PBPs) et de trouver de nouvelles cibles qui permettent de mettre la biosynthèse du peptidoglycane (PG) sous contrôle. Mettre au point une méthode originale de marquage du PG constituerait une nouvelle stratégie qui permettrait d’identifier de nouveaux antibiotiques et cibles dignes d'inhibition. Dans Escherichia coli, l’acide méso-diaminopimélique (A2pm) est une molécule clé pour la réticulation du PG. Au cours de ce travail, nous avons synthétisé la méso-lanthionine, l'analogue soufré du méso A2pm, et certains de ses dérivés. Leur utilisation en vue du marquage a ensuite éte étudiée car ces composés sont succeptibles d’entrer dans la biosynthèse du PG par addition enzymatique sur UDP (S) Ala γ (R) Glu catalysée par l'enzyme MurE. Une autre approche investiguée consistait à introduire les lanthionines via la voie de recyclage du PG en remplaçant le tripeptide naturel (S) Ala γ (R)-Glu-meso-A2pm par des analogues de tripeptide contenant des lanthionines modifiées. Nous avons donc développé une nouvelle synthèse stéréosélective des trois diastéréoisomères de la lanthionine (meso Lan, (R,R)-Lan et (S,S)-Lan) et d'un analogue α benzylé. De bons rendements à l'échelle du gramme et d’excellents excès diastéréomériques (> 99%), sans aucune étape d'enrichissement, ont été obtenus en solution aqueuse. Les expériences biologiques ont montré l'incorporation des méso-Lan et (R,R)-Lan dans le PG. Sur base de ces résultats, les diastéréoisomères de la [35S]lanthionine pourraient être utilisés pour étudier la biosynthèse du PG et son renouvellement lors de la croissance et de la division cellulaire. Malheureusement, la lanthionine α-benzylée n'a pas été incorporée. Ce résultat indique que l'introduction de lanthionines avec un groupe aromatique substitué à cette position n'est pas réalisable via la réaction catalysée par MurE. Nous avons également développé une synthèse de lanthionines protégées portant un groupe α-alkyle utile pour la préparation d'analogues de précurseurs du PG. Un excès énantiomérique de 97% a été obtenu lors de l'alkylation d'un précurseur de type oxazoline. Une réaction SN2 d’une cystéine sur le carbone β de sulfamidates cycliques a été couronnée de succès, et ce, en dépit du carbone α stériquement encombré. Ainsi, nous avons pu obtenir diverses lanthionines protégées α alkylées. Ces produits sont des molécules prometteuses pour la synthèse peptidique. Dans ce rapport, nous décrivons également une synthèse diastéréosélective de tripeptides α substitués. Ces composés contenant un marqueur fluorescent ou un groupe photoactivable situé sur un carbone α pourraient être utilisés pour étudier la biosynthèse du PG. Nous avons obtenu des sulfamidates chiraux α alkylés avec un excès énantiomérique de 89 à 97%. Ces sulfamidates constituent d’excellents électrophiles avec la cystéine pour fournir des lanthionines. Les lanthionines ont ensuite été converties aisément en tripeptides (S)-Ala-γ-(R)-Glu-(R,S/R,R)-α-benzyl-lanthionine et en analogues porteurs d’un phénylazido lors d’une réaction monotope. Ces tripeptides sont des substrats de Mpl in vitro. Nous n’avons cependant pas observé l’incorporation de ces tripeptides dans le PG d’E. coli.
