Reference : Contribution à l'étude de métabolites secondaires d'Harmonia axyridis (Pallas) en rel...
Dissertations and theses : Master's dissertation
Life sciences : Multidisciplinary, general & others
http://hdl.handle.net/2268/9136
Contribution à l'étude de métabolites secondaires d'Harmonia axyridis (Pallas) en relation avec la coloration de l'insecte
French
Fischer, Christophe mailto [Université de Liège - ULg > > > Form. doct. sc. agro. & ingé. biol.]
2009
Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques de Gembloux, ​Gembloux, ​​Belgium
Bioingénieur en chimie et bio-industries
Lognay, Georges mailto
Heuskin, Stéphanie mailto
[fr] Harmonine ; Méthoxypyrazine ; Coccinellidés ; Aposématisme ; Alcaloïde ; Harmonia axyridis ; Thermodésorption ; Fast-GC ; Validation
[en] Harmonine ; Methoxypyrazine ; Coccinellidae ; Aposematism ; Alkaloid ; Harmonia axyridis ; Thermodesorption ; Fast-GC ; Validation
[fr] Ce travail a pour objectif l’étude de métabolites secondaires d’Harmonia axyridis (Pallas) (Coccinellidés) en relation avec la coloration de l’insecte. Dans ce but, deux méthodes analytiques originales de quantification de métabolites secondaires de cet insecte ont été mises au point en vue de doser l’harmonine, son principal alcaloïde défensif, et la 2-isopropyl-3-méthoxypyrazine, un composé fortement odorant probablement impliqué dans la communication entre individus et dans l’aposématisme de cet insecte. Une méthode de caractérisation de la coloration élytrale par analyse d’image a également été développée.
Tout d’abord, une méthode d’extraction, d’acétylation et de purification d’harmonine à partir d’Harmonia axyridis a été mise au point en vue de l’obtention de standard de calibration, cette molécule n’étant pas disponible commercialement. L’identité du composé extrait a été confirmée par spectrométries de masse et RMN. La pureté GC de cette N,N-diacétylharmonine est de 100%. Sa stabilité en solution acétonique à 4°C a été vérifiée. En utilisant cette molécule purifiée, une méthode originale de quantification de l’harmonine par chromatographie gazeuse ultra rapide a été mise au point et validée par profil d’exactitude. Cette méthode permet la quantification de l’harmonine contenue dans un seul insecte.
Ensuite, une méthode originale de détermination du taux d’émission de 2-isopropyl-3-méthoxypyrazine d’une Harmonia axyridis par TD-GC-MS a été validée.
Ces deux méthodes quantitatives et le script d’analyse d’image ont été appliqués à l’analyse de 80 Harmonia axyridis réparties en quatre groupes d’au moins 15 individus sur base du morphotype et de la teinte élytrale. Le taux moyen d’émission de 2-isopropyl-3-méthoxypyrazine d’un individu soumis à un stress est de 707pg/4h avec un écart-type de 1766pg/4h. La teneur moyenne en harmonine est de 106,6µg/individu avec un écart-type de 80,2µg/individu. Une forte variabilité entre individus est donc observée. Les résultats ont été traités statistiquement afin de mettre en évidence d’éventuelles corrélations entre ces facteurs. Il ressort que la coloration élytrale semble liée à la teneur en harmonine de l’insecte et à son taux d’émission de pyrazine. En effet, les individus de coloration orange non mélanique présentent une teneur en harmonine significativement supérieure aux autres colorations étudiées tandis que les individus rouges mélaniques présentent un taux d’émission de pyrazine moindre.
Des pistes explicatives de la variabilité observée ont été recherchées. Il semblerait que le motif élytral soit essentiellement influencé par des facteurs génétiques et que la teinte soit influencée par des facteurs environnementaux et saisonniers. La teneur en harmonine et le taux d’émission de pyrazine ne semblent pas influencés par la population d’origine sur une zone géographiquement restreinte. Ces conclusions sont à prendre avec beaucoup de précautions étant donné la taille des échantillons. Il ne s’agit que de pistes pour des recherches futures.
La méthode de dosage de l’harmonine a été adaptée au dosage de cet alcaloïde dans Coccinella septempunctata L. en vue de l’étude de la prédation intraguilde via la recherche d’alcaloïdes exogènes séquestrés.
Le script d’analyse d’image semble utilisable comme outil de classification et de caractérisation de la coloration élytrale.
[en] This work aims to study secondary metabolites of Harmonia axyridis (Pallas) (Coccinellidae) in relation with the insect color. To achieve this goal, two original quantification methods of insect secondary metabolites have been devised. The first one allows quantifying harmonine which is its main defense alkaloid; the other one permit to determine its emission rate of 2-isopropyl-3-methoxypyrazine which is highly odorous compound probably involved in the communication between individuals and in the aposematism of this insect. As well, a method for characterizing the elytra color has been developed.
First of all, a method of extraction, acetylation and purification of harmonine from Harmonia axyridis has been devised to obtain a calibration standard because this molecule is not available commercially. The identity of the compound extracted has been confirmed by mass spectrometry and NMR. The GC purity of this N,N-diacetylharmonine is of 100%. Its stability in acetonic solution at 4°C has been verified. Using this purified molecule, an original method of harmonine quantification has been developed by ultra fast gas chromatography and validated using accuracy profile. This method allows quantifying harmonine in one single insect.
Afterward, an original method for determining the emission rate of 2-isopropylmethoxypyrazine of a Harmonia axyridis by TD-GC-MS has been validated.
These two methods and the picture analysis script have been used to analyze 80 Harmonia axyridis divided in four groups of at least 15 individuals on basis of the morph type and the elytra hue. The mean 2-isopropyl-3-methoxypyrazine emission rate of a Harmonia under stress is of 707 pg/4h with a standard deviation of 1766pg/4h. The mean harmonine content is of 106,6µg/individual with a standard deviation of 80,2µg/individual. So a strong variability between individuals is observed. Results have been statistically analyzed in order to show potential correlations between these factors. What emerges is that elytra color seems to be linked with the insect harmonine content and its pyrazine emission rate. Individuals with a non-melanic orange color present a harmonine content significantly higher than other studied colors while individuals with a melanic red color show a lower pyrazine emission rate.
Leads explaining the high variability observed have been researched. It seems that elytra black pattern is mainly influenced by genetic factors and that the hue is influenced by environmental and seasonal factors. The harmonine content and the pyrazine emission rate do not seem influenced by the population of origin in a limited geographic area. These conclusions are to take with caution because of samples size. It only opens ways to future researches.
The harmonine quantification method has been transposed to Coccinella septempunctata in order to study intraguilde predation by searching exogenous sequestrated alkaloids.
It seems possible to use the image analysis script as classification and elytra color characterization tool.
Researchers ; Students ; Others
http://hdl.handle.net/2268/9136

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