Abstract :
[en] Canine idiopathic pulmonary fibrosis (cIPF) is a fibrotic disease of the pulmonary parenchyma, mainly seen in the West Highland white terrier. It is characterized by exercise intolerance and cough with a progressive deterioration until death from respiratory insufficiency. Clinical, tomodensitometric and histological characteristics of cIPF have been described recently. However, this disease remains largely unknown and the clinicians are dealing with two major challenges: confirmation of the diagnosis, which requires many complementary exams, and absence of effective treatment. Identification of a targeted therapy is difficult without having a good understanding of the mechanisms leading to pulmonary parenchyma fibrosis. A similar disease, the idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is recognized in humans and cIPF might be interesting as a spontaneous model. This project in dogs was undertaken to answer, at least partly, to these challenges. The aims were to elucidate some mechanisms involved in cIPF pathogenesis and to identify biomarkers that could be used in the diagnosis process. The hypotheses were first that analysis of the transcriptome through microarray experiment would identify altered biological functions in cIPF, highlight specific molecules with an altered expression and identify potential biomarkers. Another hypothesis was the transforming growth factor beta 1 (TGFB1) pathways, considered central in the pathogenesis of IPF, would also be modified in cIPF. Finally, ET1, a known biomarker in human IPF, might also be an interesting biomarker in dogs.
Gene expression analysis through microarray analysis, combined with the use of IPA, a data analysis program, identified altered biological functions in cIPF: cellular growth and proliferation, developmental processes, cellular movement, cell to cell signaling and interaction and antigen presentation. Some genes highlighted in the microarray experiment were then analyzed individually. Quantitative RT-PCR analysis confirmed an upregulation of the expression of CCL2, CCL7, CXCL14, IL8 and FAP (fibroblast activation protein) as well as a downregulation of the expression of PLUNC (palate, lung and nasal epithelium associated). We then complete the gene expression analysis with a search for potential biomarkers. Thirty-four potential biomarkers were identified with 32 biomarkers potentially measurable in blood (including CCL2, serum amyloid 1, IL8) and 2 biomarkers measurable only in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) (PLUNC and mesothelin). This approach was validated by measurement in serum of one of this biomarker: CCL2. CCL2 serum concentration was higher in affected WHWT compared to healthy WHWT and also higher in dogs with cIPF compared to dogs with chronic bronchitis (CB) or eosinophilic bronchopneumopathy (EBP). Based on serum CCL2 determination, cIPF was diagnosed with a sensibility of 92% and a specificity of 80%.
We then studied TGFB1 and part of its storage, activation and signaling pathways. TGFB1 gene expression was not significantly different in the pulmonary parenchyma between affected and control dogs. However, in affected dogs, increased TGFB1 protein levels were seen by immunohistochemistry in fibrotic areas. High expression of bothTGFB1 type I receptor and phosphorylated Smad2/3, markers of an active intracellular TGFB1 signal, were seen in epithelial cells. No difference in expression for the storage proteins LTBP1 and LTBP2 was seen while expression of LTBP4 was significantly decreased in dogs with cIPF. Concerning the proteins involved in TGFB1 activation, gene expression was decreased for integrin subunit β8, increased for thrombospondin-1 and not modified for integrin subunit β6. Expression of Smad 7, involved in intracellular TGFB1 signal inhibition, was not modified. No difference for TGFB1 serum concentration was seen between WHWT with cIPF and healthy WHWT. A multivariate analysis performed on healthy dogs showed no age effect but a significant breed effect with higher levels in predisposed breeds.
We evaluated part of the serotonin pathway, as one of its receptor (5HTR2B) was highlighted during the gene expression analysis. Serotonin has also been involved in the pathogenesis of human IPF and described to be of potential use as a biomarker in degenerative mitral valve disease in dogs. Expression of 2 serotonin receptors (5HTR2A and 5HTR2B), evaluated by quantitative RT-PCR in pulmonary tissue, was not different between dogs with cIPF and control dogs while expression of the serotonin transporter (5HTT) was significantly lower in affected dogs. No difference in serotonin serum level was seen between affected and healthy WHWT or between dogs with cIPF, CB or EBP.
ET1 was evaluated as a biomarker in serum and BALF. ET1 serum concentration was not different between healthy WHWT and Beagles. Covariance analysis did not reveal any significant age effect. Serum levels were significantly higher in dogs with cIPF compared to dogs with CB or EBP. ROC curve analysis was then used to evaluate its diagnostic performances. The area under the curve was 0,818 with a sensitivity of 91.7% and a specificity of 87.5%. ET1 was also measured in the BALF in a small number of dogs. Its concentration was measurable in all dogs with cIPF while it was below the detection limit in all other dogs tested (healthy and with CB).
Even though cIPF and human IPF are not completely identical from clinical, tomodensitometric or histological points of view, these results show that both canine and human diseases share molecular pathways, supporting the idea that cIPF might have an interest as spontaneous model.
This work allowed a better understanding of cIPF pathogenesis. Gene expression analysis in the pulmonary parenchyma of affected dogs first identified several altered biological functions that should be analyzed in details in further studies. A more targeted analysis of some genes confirmed an upregulated expression of CCL2, CCL7, CXCL14, IL8 and FAP. Such a positive regulation of the expression of various inflammatory cytokines tends to suggest that inflammation might have a role in cIPF pathogenesis. Some of these cytokines also have profibrotic properties. PLUNC was one of the top down-regulated genes. Roles of the protein are still largely unknown; it might have a role in the inflammatory response and in the innate immunity. Developmental pathways were also altered in cIPF and quantitative RT-PCR confirmed an upregulation of FAP, a protein normally expressed in areas of tissue remodeling during fetal development and also positively regulated in human IPF.
This study has shown that there is an active TGFB1 signal in the lungs of dogs with cIPF, especially at the level of the pathological epithelium. TGFB1 storage and activation pathways also seemed to be altered. Elevated TGFB1 circulating levels were found in predisposed breeds, which might explain at least partly their susceptibility for cIPF. Because of these results and its well-known profibrotic properties, we can suggest that TGFB1 is probably involved in cIPF pathogenesis and that modulation of its storage, activation or intracellular signaling might offer potential therapeutic targets.
Our preliminary results are not in favor of a significant modification of the serotonin pathways in cIPF, although a decreased expression of 5HTT was seen in affected dogs and might have an impact on the amount of serotonin present locally. However, other studies are needed to conclude.
Finally, several potential biomarkers have been identified and some of them were evaluated in details. While serum measurements performed for TGFB1 and serotonin indicated that these molecules have no interest as diagnostic biomarkers, ET1 and CCL2 were identified as interesting candidates with good diagnostic performances. However these results need to be confirmed in an independent validation cohort and the interest of combining both biomarkers should be evaluated.
[fr] La fibrose pulmonaire idiopathique canine (FPIc) est une affection fibrotique du parenchyme pulmonaire, majoritairement rencontrée chez le West Highland White Terrier (WHWT). Elle se traduit par une intolérance à l’effort et de la toux avec aggravation progressive jusqu’au décès de l’animal par insuffisance respiratoire. Ses caractéristiques cliniques, tomodensitométriques et histologiques ont été décrites récemment. Cette maladie reste toutefois très peu connue et le clinicien doit faire face à deux challenges majeurs : la confirmation du diagnostic, qui requiert de nombreux examens complémentaires, et l’absence d’un traitement efficace. Or, l’identification d’une thérapie ciblée est très difficile en l’absence d’une bonne compréhension des mécanismes conduisant à la fibrose du parenchyme pulmonaire. Une affection comparable est par ailleurs rencontrée chez l’homme, la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), et la FPIc pourrait avoir un intérêt en tant que possible modèle spontané. Ce projet a donc été entrepris afin de répondre au moins partiellement à ces différents challenges. Ces objectifs étaient ainsi d’élucider certains mécanismes intervenant dans la pathogénie de la FPIc et d’identifier des biomarqueurs pouvant aider à son diagnostic. Les hypothèses de travail étaient tout d’abord que l’analyse du transcriptome au niveau pulmonaire par la technique des microdamiers permettrait d’identifier de grandes fonctions biologiques altérées lors de FPIc, de mettre en avant plus spécifiquement certaines molécules dont l’expression est fortement altérée et d’identifier des biomarqueurs potentiels. Une autre hypothèse était que les voies du « transforming growth factor beta 1 » (TGFB1), molécule centrale dans la pathogénie de la FPI chez l’homme, seraient également altérées lors de FPIc. Enfin, l’endothéline-1 (ET1), biomarqueur connu dans la FPI humaine, pourrait également avoir un intérêt en tant que biomarqueur chez le chien.
L’analyse du transcriptome au niveau pulmonaire, par la technique des microdamiers et grâce à l’utilisation d’un programme informatique d’analyse de données, a tout d’abord identifié différentes fonctions biologiques altérées lors de FPIc : la croissance, la prolifération, le mouvement et le développement cellulaires, le développement et le fonctionnement du système musculo-squelettique, le développement embryonnaire, la signalisation et les interactions intercellulaires et la présentation antigénique. Certains gènes mis en avant par cette analyse (particulièrement surexprimés ou sous-exprimés chez l’animal malade,) ont ensuite été étudiés individuellement. L’analyse par RT-PCR quantitative a confirmé une régulation positive de l’expression de CCL2, CCL7, CXCL14, IL8 et FAP (fibroblast activation protein) ainsi qu’une régulation négative de la PLUNC (palate, lung and nasal epithelium associated). Nous avons ensuite complété l’analyse du profil d’expression par une recherche de biomarqueurs potentiels. Trente-quatre biomarqueurs potentiels ont ainsi pu être identifiés dont 32 pourraient être mesurables dans le sang (dont le CCL2, l’amyloïde sérique 1 et l’IL8), et 2 uniquement dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire (LLBA) (PLUNC et mésothéline). La validité de cette approche a été confirmée par la mesure dans le sérum de l’un de ces biomarqueurs : le CCL2. Une concentration sérique plus élevée a été retrouvée chez les WHWT atteints en comparaison de WHWT sains. Elle était également plus élevée chez les chiens atteints de FPIc que chez ceux atteints de bronchite chronique (BC) ou de bronchopneumopathie éosinophilique (BPE) ; une FPIc étant diagnostiquée avec une sensibilité de 92% et une spécificité de 80%.
Nous avons ensuite étudié le TGFB1 et certaines de ses voies de stockage, d’activation et de signalisation. L’expression génique pour le TGFB1 n’était pas significativement différente au niveau du parenchyme pulmonaire entre des chiens atteints de FPIc et des chiens contrôles. Toutefois, lors de FPIc, des taux élevés de la protéine TGFB1 ont été mis en évidence par immunohistochimie dans les zones fibrotiques. Les cellules épithéliales présentaient également une expression importante en récepteur de type I du TGFB1 et en Smad 2/3 phosphorylées, marqueur d’une activation de la signalisation intracellulaire du TGFB1. Aucune différence d’expression génique n’était notée entre des chiens atteints et des chiens contrôles pour les protéines de stockage LTBP1 et LTBP2 alors que l’expression de LTBP4 était significativement diminuée chez les chiens atteints. Concernant l’expression des protéines impliquées dans l’activation du TGFB1, l’expression de la sous-unité intégrine β8 était significativement diminuée et l’expression de la thrombospondine-1 significativement augmentée lors de FPIc ; celle de la sous-unité β6 n’était pas modifiée. L’expression de Smad 7, une protéine inhibant la signalisation intracellulaire du TGFB1, n’était pas non plus modifiée. Aucune différence dans la concentration sérique en TGFB1 n’était notée entre des WHWT atteints et sains. Une analyse multivariée réalisée chez des chiens sains de différentes races n’a pas mis en évidence d’effet de l’âge mais un effet significatif du facteur race avec une concentration sérique en TGFB1 significativement plus élevée dans les races prédisposées.
Nous avons ensuite analysé une partie des voies de la sérotonine, un de ces récepteurs (5HTR2B) ayant été retrouvé lors de l’analyse du profil d’expression de la FPIc. La sérotonine a également déjà été impliquée dans la pathogénie de la FPI chez l’homme et décrite comme biomarqueur potentiel chez le chien lors d’endocardiose mitrale. L’expression des deux récepteurs de la sérotonine (5HTR2A, 5HTR2B), évaluée par RT-PCR quantitative à partir du tissu pulmonaire, n’était pas différente entre les chiens avec FPIc et les chiens contrôles, alors que l’expression du transporteur de la sérotonine (5HTT) était significativement plus faible dans le groupe FPIc. Concernant la concentration sérique en sérotonine, aucune différence n’a été notée entre les WHWT atteints de FPIc et les WHWT sains ni entre les chiens avec FPIc et les chiens avec BC ou BPE.
L’ET1 a été évaluée en tant que biomarqueur dans le sérum et le LLBA. Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les concentrations sériques en ET1 obtenues chez les WHWT sains et les Beagles. L’analyse de covariance n’a pas mis en évidence d’influence du facteur âge. La concentration sérique en ET1 était significativement plus élevée lors de FPIc par rapport à la BPE et à la BC. Les performances de l’ET1 à distinguer une FPIc d’une BC ou d’une BPE ont ensuite été évaluées par l’analyse de la courbe ROC. L’aire sous la courbe était de 0,818 et la sensibilité et la spécificité de 91,7% et 87,5% respectivement. Au cours de cette étude, l’ET1 a également été mesurée dans le LLBA chez un nombre de limité de chiens. Elle était mesurable chez tous les chiens atteints de FPIc alors que sa concentration était inférieure au seuil de détection chez les autres chiens testés (sains et atteints de BC).
Même si la FPIc et la FPI chez l’homme ne sont pas parfaitement identiques d’un point de vue tomodensitométrique, histologique ou pathogénique, ces résultats mettent enfin en évidence que ces deux affections partagent certains mécanismes moléculaires et que la FPIc pourrait ainsi avoir un intérêt en tant que modèle spontané.
Ce travail nous a permis de mieux comprendre la pathogénie de la FPIc. L’étude du profil d’expression génique au niveau pulmonaire chez les chiens atteints a d’abord permis d’identifier différentes fonctions biologiques altérées lors de FPIc et qui pourront faire l’objet par la suite d’une étude plus détaillée. L’analyse plus ciblée de certains gènes a confirmé une surexpression de CCL2, CCL7, CXCL14, IL8 et de FAP. Ces résultats indiquent une régulation positive de l’expression de différentes cytokines inflammatoires, suggérant que l’inflammation pourrait avoir un rôle dans la pathogénie de la FPIc. Par ailleurs, certaines de ces cytokines ont également des propriétés profibrotiques. Le gène de la PLUNC était l’un de ceux dont l’expression était nettement réprimée. Le rôle de cette protéine reste encore à définir, elle pourrait notamment intervenir dans la réponse inflammatoire et l’immunité innée. Les voies du développement faisait également partie des voies altérées dans la FPIc. Parmi les gènes impliqués, l’analyse par RT-PCR quantitative a confirmé une surexpression de la FAP, protéine normalement exprimée dans les zones de remodelage tissulaire lors du développement embryonnaire et également régulée positivement lors de FPI chez l’homme.
Cette étude a permis de démontrer qu’une signalisation active en TGFB1 existait au sein des poumons atteints de FPIc, notamment au niveau de l’épithélium pathologique. Elle suggère également que les voies de stockage et d’activation du TGFB1 sont altérées lors de FPIc. Des taux élevés de TGFB1 circulant sont retrouvés dans les races prédisposées, ce qui pourrait au moins partiellement influencer leur susceptibilité à la FPIc. Au regard des propriétés profibrotiques du TGFB1 et de ces résultats, nous pouvons suggérer que le TGFB1 est probablement impliqué dans la pathogénie de la FPIc et que la modulation de son stockage, de son activation ou de sa signalisation intracellulaire représente des cibles thérapeutiques potentielles.
Nos premiers résultats ne sont pas en faveur d’une modification importante des voies de la sérotonine dans la FPIc et donc de son implication dans la pathogénie. Une expression pulmonaire plus faible du transporteur 5HTT a toutefois été notée chez les chiens atteints de FPIc en comparaison de chiens sains. Cette régulation négative de l’expression du 5HTT pourrait avoir un impact sur la quantité de sérotonine présente au sein du tissu. Il s’agit toutefois de spéculations et d’autres études sont nécessaires pour conclure.
Au cours de ce travail, différents biomarqueurs potentiels ont été identifiés et certains ont été évalués en détail. Alors que les mesures sériques réalisées lors de l’étude du TGFB1 et de la sérotonine indiquent que ces derniers n’ont pas d’intérêt en tant que biomarqueur diagnostique, il semble que l’ET1 et le CCL2 sériques présentent de très bonnes performances diagnostiques. Ces résultats doivent toutefois être validés sur une population indépendante. La combinaison de différents biomarqueurs identifiés par la suite pourrait également s’avérer intéressante.
