Doctoral thesis (Dissertations and theses)
Les effets délétères métaboliques et oxydants induits lors d'un sepsis sur la fonction rénale
Quoilin, Caroline
2014
 

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Keywords :
Sepsis; Inflammation; Insuffisance rénale aiguë; Métabolisme; Dysfonction mitochondriale; Hypoxie cytopathique; Stress oxydant; Monoxyde d’azote
Abstract :
[en] Acute kidney injury (AKI) is a frequent complication of sepsis that can increase mortality as high as 70%. The pathophysiology of this kidney failure was previously believed to be secondary to decreased global renal perfusion causing hypoxia-induced injury. However, new research suggests this paradigm is overly simplistic, and injury is now considered multifactorial in origin. Mechanisms that contribute to kidney injury mainly include inflammation, alterations in microvascular renal blood flow and changes in bioenergetics. To study the mechanism of oxygen regulation in acute kidney injury during sepsis, we developed a sepsis-induced in vitro model using proximal tubular epithelial cells (HK-2) exposed to a bacterial endotoxin (lipopolysaccharide, LPS). Our first investigation, by using both high-resolution respirometry and electron spin resonance spectroscopy, showed that HK-2 cells exhibit a decreased oxygen consumption rate when treated with LPS. Surprisingly, this cellular respiration alteration persists even after the stress factor is removed. We suggested that this irreversible decrease in renal oxygen consumption after LPS challenge is related to a pathologic metabolic down-regulation such as a lack of oxygen utilization by cells for ATP production. In the long term, this metabolic disturbance leads cells to a predominantly apoptotic death. To confirm this hypothesis of cytopathic hypoxia, we demonstrated that this alteration in the renal respiratory function is mainly due to an impairment in the metabolic activity of HK-2 cell mitochondria. Following LPS treatment, the oxidative phosphorylation is interrupted because of the inhibition of cytochrome c oxidase activity. As a consequence, disruptions in the electron transport and the proton pumping across the system occur, leading to a decrease of the mitochondrial membrane potential, the release of apoptotic-inducing factors and a decrease in ATP production. To clarify the mechanism by which the LPS induces mitochondrial alterations, we studied the oxidative stress generation in HK-2 cells. Interestingly, we revealed that the induction of a cytosolic oxidative stress is an event that appears before mitochondrial dysfunction in the LPS-treated HK-2 cells. This primary redox state is notably due to the activation of the two enzymes NADPH oxidase 4 and inducible NO synthase. The simultaneous production of anion superoxide and nitric oxide strongly suggests the formation of peroxynitrite, a relative stable powerful oxidant that can diffuse through mitochondrial compartments and undergo cytotoxic reactions. To our knowledge, our model reveals for the first time the role of NADPH oxidase-derived cytosolic ROS in triggering tubular cell damage. Moreover, after being first target of the oxidative stress, mitochondria become in turn producer of reactive oxygen species that carry on mitochondrial dysfunction. It seems thus that a mechanism of oxidative stress-induced redox cycling is a main cause of the mitochondrial dysfunction of LPS-treated HK-2 cells. The role of oxidants in mitochondrial dysfunction was further confirmed by the use of iNOS inhibitors or antioxidants that preserve cytochrome c oxidase activity and block mitochondrial membrane potential dissipation. Overall, these results suggest that sepsis-induced AKI should not only be regarded as failure of energy status but also as an integrated response, including transcriptional events, ROS signaling, mitochondrial activity and metabolic orientation such as apoptosis.
[fr] L'insuffisance rénale aiguë (IRA) est une complication fréquente du sepsis qui peut augmenter la mortalité du patient jusqu'à 70 %. L'effondrement de la perfusion rénale globale a longtemps été considéré comme le facteur essentiel d'apparition de lésions cellulaires hypoxiques à l'origine de la défaillance du rein. Cependant, de nouvelles recherches ont suggéré que ce paradigme était trop simpliste et il est maintenant admis que l'origine des lésions rénales est multifactorielle. Les mécanismes qui sous-tendent l'apparition d'une telle défaillance sont complexes et impliquent la dérégulation de la réponse inflammatoire, l'altération de la microcirculation rénale et la perturbation des processus bioénergétiques. Pour déterminer les mécanismes mis en jeu dans la modulation respiratoire des cellules rénales lors d'un sepsis, nous avons développé un modèle in vitro d'IRA septique qui consiste à soumettre des cellules tubulaires rénales humaines (HK-2) à une endotoxine (lipopolysaccharide, LPS). Par l'utilisation des deux techniques de respirométrie de haute résolution et de spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, nous avons alors montré que l'incubation des cellules HK-2 avec le LPS induit une diminution significative de leur consommation en oxygène. Étonnamment, le retour dans un environnement sans endotoxine ne s'accompagne pas d'un rétablissement de l'activité respiratoire des cellules. Nous avons donc émis l'hypothèse que cette décroissance irréversible dans la consommation en oxygène des cellules rénales traitées au LPS serait due à une sous-régulation métabolique pathologique se traduisant par l'incapacité des cellules à utiliser l'oxygène disponible pour produire de l'ATP. Pour confirmer cette hypothèse d'hypoxie cytopathique, nous avons démontré que cette altération de la respiration des cellules HK-2 provient surtout d'un dysfonctionnement de l'activité métabolique des mitochondries. À la suite du traitement LPS, la phosphorylation oxydative est interrompue consécutivement à l'inhibition de l'activité de la cytochrome c oxydase. Par conséquent, le flux d'électrons et le pompage des protons sont perturbés au niveau de la chaîne respiratoire, conduisant à une chute du potentiel de membrane mitochondrial, une libération de facteurs pro-apoptotiques et une diminution de la production d'ATP. À long terme, cette perturbation métabolique conduit les cellules vers une mort majoritairement apoptotique. Pour clarifier le mécanisme par lequel le LPS provoque des altérations mitochondriales, nous avons étudié la possible génération d'un stress oxydant au sein des cellules HK-2. De façon intéressante, nous avons révélé que l'induction d'un stress oxydant dans le cytosol des cellules HK-2 traitées au LPS est un événement qui apparaît avant la dysfonction mitochondriale. Cet état redox primaire est notamment dû à l'activation des deux enzymes NADPH oxydase 4 (NOX 4) et NO synthase inductible (iNOS). La production concomitante de leurs sous-produits, à savoir l'anion superoxyde et le monoxyde d'azote, suggère fortement la formation du peroxynitrite, puissant oxydant relativement stable qui peut diffuser dans les compartiments mitochondriaux et y induire des réactions cytotoxiques. À notre connaissance, notre modèle révèle pour la première fois la contribution de l'anion superoxyde originaire de NOX 4 dans les lésions tubulaires rénales. Par ailleurs, après avoir été la cible du stress oxydant, les mitochondries deviennent elles-mêmes par la suite génératrices d'espèces réactives de l'oxygène qui perpétuent le dysfonctionnement mitochondrial. Il semble donc qu'un mécanisme de cycle redox induit par un stress oxydant soit la cause principale de l'altération de la fonction mitochondriale des cellules HK-2 traitées au LPS. Le rôle des espèces oxydantes dans le dysfonctionnement mitochondrial induit par le LPS a d'ailleurs été confirmé avec l'utilisation d'inhibiteurs de la iNOS ou d'antioxydants qui préservent l'activité de la cytochrome c oxydase et empêchent la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'IRA induite par le sepsis ne doit pas seulement être considérée comme une défaillance de l'énergétique cellulaire, mais plutôt comme une réponse intégrée qui comporte une signalisation intracellulaire redox, une perturbation de l'activité mitochondriale et une réorientation métabolique tels que l'apoptose.
Research center :
Laboratoire de Spectroscopie Biomédicale
Disciplines :
Biochemistry, biophysics & molecular biology
Physical, chemical, mathematical & earth Sciences: Multidisciplinary, general & others
Author, co-author :
Quoilin, Caroline ;  Université de Liège - ULiège > Département de physique > Spectroscopie biomédicale
Language :
French
Title :
Les effets délétères métaboliques et oxydants induits lors d'un sepsis sur la fonction rénale
Alternative titles :
[en] Exploring metabolic dysfunction and oxidative stress in kidney failure during sepsis
Defense date :
03 September 2014
Number of pages :
x,195
Institution :
ULiège - Université de Liège
Degree :
Docteur en Sciences
Promotor :
Hoebeke, Maryse  ;  Université de Liège - ULiège > Complex and Entangled Systems from Atoms to Materials (CESAM)
President :
Ghosez, Philippe  ;  Université de Liège - ULiège > Complex and Entangled Systems from Atoms to Materials (CESAM)
Secretary :
Mouithys-Mickalad, Ange ;  Université de Liège - ULiège > Unités de recherche interfacultaires > Centre Interdisciplinaire de Recherche sur le Médicament (CIRM)
Jury member :
Dauby, Pierre  ;  Université de Liège - ULiège > GIGA > GIGA In silico medecine - Thermodynamics of Irreversible Processes
Fontaine-Aupart, Marie-Pierre
Franck, Thierry  ;  Université de Liège - ULiège > Centres généraux > Centre de l'oxygène : Recherche et développement (C.O.R.D.)
Harrois, Anatole
Funders :
F.R.S.-FNRS - Fonds de la Recherche Scientifique [BE]
ULiège - Université de Liège. Patrimoine
Available on ORBi :
since 09 August 2014

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