Abstract :
[en] Among the neurodegenerative amyloidoses, ten disorders, referred to as polyglutamine (polyQ) diseases and including Huntington's disease and several spinocerebellar ataxias, are associated with ten proteins within which a polyQ tract is expanded above a threshold of typically 35-45 glutamine residues. Such expanded polyQ tracts lead to the aggregation of the host protein into amyloid fibrils that accumulate in the nucleus of some populations of neurons; these aggregates or some of their precursors are thought to contribute to neuronal death. So far, no preventive or curative treatment exists for these devastating pathologies. While the expansion of the polyQ tract above the threshold is the determinant factor for aggregation, recent studies suggest that non-polyQ regions of these proteins can play a significant role, either preventative or facilitative, in the aggregation process. The general principles governing the complex interplay between the role of the expanded polyQ tract and the role of the non-polyQ regions in the aggregation process are not well understood yet. In order to develop therapeutic strategies, it is important to better understand this complex interplay. To contribute to this aim, we have engineered chimeric proteins via the insertion of polyQ repeats of various lengths (23, 30, 55 and 79Q) into two sites (197 and 216) of the BlaP beta-lactamase from Bacillus licheniformis 749/C. The properties of these chimeric proteins recapitulate the characteristic features of the disease-associated polyQ proteins, i.e. (i) there is a minimum number of inserted glutamines (threshold) required to trigger the aggregation of the chimeras into amyloid fibrils, and (ii) above the threshold, the longer the polyQ tract, the faster the aggregation. Interestingly, for the same polyQ length, the chimeras with insertions in position 216 have an increased propensity to form amyloid fibrils compared to their counterparts with insertions in position 197. These findings highlight the strong influence of the overall protein context on aggregation triggered by expanded polyQ tracts.
This thesis addresses the use of the variable domains of camelid heavy-chain antibodies, referred to as nanobodies or VHHs, as structural and mechanistic probes to better understand the different aggregating properties of the two sets of BlaP-polyQ chimeras (197 and 216). We have also performed limited proteolysis experiments and transglutaminase-mediated reactions on the monomeric form of the BlaP-polyQ chimeras to further investigate the effects of the polyQ insertions on the structure and dynamics of the BlaP moiety, as well as the structure of the polyQ tract itself.
From the blood of a llama immunised with BlaP197(Gln)55, we isolated more than 60 VHHs specific to the BlaP-polyQ chimeras. Twenty eight of them were produced, purified and characterised. These VHHs were found to be all specific to the BlaP moiety and could be classified into four different groups recognising distinct epitopes on the surface of BlaP. One representative VHH of each group (i.e. cAb-A3S, cAb-H7S, cAb-F11N and cAb-G10S) was selected as probe to investigate the mechanism of aggregation of the BlaP-polyQ chimeras. The epitope of three of them was determined by X-ray diffraction and/or by NMR spectroscopy. Although they recognise distinct epitopes and exhibit different affinities for BlaP, the binding of the four VHHs significantly slows down the aggregation of all the BlaP-polyQ chimeras investigated (i.e. BlaP197(Gln)55, BlaP197(Gln)79 and BlaP216(Gln)79). The extent of inhibition depends however on the chimera and on the experimental conditions. We show that the inhibition of the aggregation of BlaP197(Gln)55 and BlaP197(Gln)79 upon binding of the four VHHs is correlated with the stabilisation of their native state. In the case of BlaP216(Gln)79, the extent of inhibition could not be only correlated to the stabilisation of its native state; the location of the epitope of the VHH is instead also determinant. This observation demonstrates that the lower thermodynamic stability of BlaP216(Gln)79 is not the unique factor responsible for its increased aggregation propensity. It also further highlights the complexity of the aggregation mechanism of polyQ proteins and the strong influence of the non-polyQ regions on the amyloid fibril formation triggered by the expanded polyQ tract. All together our results suggest that antibodies or antibody fragments raised against the non-polyQ regions of polyQ proteins associated with diseases could constitute a relevant therapeutic strategy. They also further demonstrate the power of nanobodies as probes to get a deeper knowledge of the underlying mechanisms of amyloid fibril formation.
The preliminary limited proteolysis and transglutamination experiments obtained suggest that the polyQ tracts are all flexible, except that of 23 glutamines inserted in position 197 of BlaP, which seems to be more rigid than the others. The results obtained confirm that, globally, the structure of BlaP is not significantly modified by the insertions while the 216 chimeras seem more dynamic than the 197 chimeras.
[fr] Parmi les amyloses neurodégénératives, dix pathologies, appelées maladies à polyglutamine (polyQ) et incluant la maladie d'Huntington et plusieurs ataxies spinocérébelleuses, sont associées à dix protéines contenant une séquence ininterrompue de glutamines de taille supérieure à un seuil dit pathologique (35-45 résidus). Cette séquence polyQ dite étendue provoque l'agrégation de la protéine qui la contient sous forme de fibres amyloïdes qui s'accumulent dans le noyau de certaines populations de neurones; ces agrégats ou certains de leurs précurseurs contribueraient à la mort neuronale. Jusqu'à présent, aucun traitement préventif ou curatif n'existe pour ces pathologies dévastatrices. Bien que l'expansion polyQ d'une taille supérieur au seuil soit le facteur déterminant dans le mécanisme d'agrégation, des études récentes suggèrent que les régions non-polyQ de ces protéines peuvent jouer un rôle significatif, préventif ou facilitateur, dans le processus d'agrégation. Les principes généraux gouvernant l'interdépendance complexe entre le rôle de la séquence polyQ étendue et le rôle des régions non-polyQ dans le processus d'agrégation sont encore mal connus. Afin de développer des stratégies thérapeutiques, il est essentiel de mieux comprendre cette interdépendance complexe. Afin de contribuer à cet objectif, nous avons créé des protéines chimères via l'insertion de séquences polyQ de différentes tailles (23, 30, 55 et 79Q) dans deux sites (197 et 216) de la bêta-lactamase BlaP de Bacillus licheniformis 749/C. Les propriétés de ces protéines chimères récapitulent celles caractéristiques des protéines associées aux maladies à polyQ, i.e. (i) il existe un nombre minimum de glutamines insérées (seuil) requis pour provoquer l'agrégation des chimères en fibres amyloïdes, et (ii) au-delà du seuil, plus la séquence polyQ est longue, plus l'agrégation est rapide. Il est intéressant de noter que, pour un même nombre de glutamines insérées, les chimères contenant les insertions en position 216 ont une propension plus élevée à s'agréger en fibres amyloïdes que les chimères contenant les insertions en position 197. Ces résultats mettent en évidence l'importance de l'influence du contexte protéique sur l'agrégation provoquée par les expansions polyQ.
Le travail réalisé dans le cadre de ma thèse consiste à utiliser des fragments d'anticorps de camélidés (nanobodies ou VHH) comme sondes structurales et mécanistiques afin de mieux comprendre les différentes propriétés d'agrégation des deux séries de chimères BlaP-polyQ (197 et 216). Nous avons également réalisé des expériences de protéolyse limitée et des réactions de transglutamination sur les monomères des chimères BlaP-polyQ afin d'étudier plus en détail l'effet des insertions polyQ sur la structure et la dynamique de BlaP, ainsi que la structure de la séquence polyQ elle-même.
A partir du sang d'un lama immunisé avec la chimère BlaP197(Gln)55, nous avons isolé plus de 60 VHH spécifiques des chimères BlaP-polyQ. Vingt-huit d'entre eux ont été produits, purifiés et caractérisés. Il s'est avéré que ces VHH sont tous spécifiques de la protéine hôte BlaP et ont pu être classés en quatre groupes reconnaissant des épitopes distincts sur la surface de BlaP. Un VHH représentatif de chaque groupe (i.e. cAb-A3S, cAb-H7S, cAb-F11N et cAb-G10S) a été sélectionné comme sonde pour étudier le mécanisme d'agrégation des chimères BlaP-polyQ. L'épitope de trois d'entre eux a été déterminé par diffraction des rayons X et/ou par spectroscopie RMN. Bien qu'ils reconnaissent des épitopes distincts de BlaP avec des affinités différentes, la liaison des quatre VHH ralentit significativement l'agrégation de toutes les chimères BlaP-polyQ testées (i.e. BlaP197(Gln)55, BlaP197(Gln)79 et BlaP216(Gln)79). Le degré d'inhibition dépend cependant de la chimère et des conditions expérimentales utilisées. Nous avons montré que l'inhibition de l'agrégation de BlaP197(Gln)55 et BlaP197(Gln)79 par la liaison des quatre VHH peut être corrélée à la stabilisation de leur état natif. Dans le cas de BlaP216(Gln)79, le degré d'inhibition ne peut pas être uniquement corrélé à la stabilisation de son état natif : la localisation de l'épitope du VHH est aussi un facteur déterminant. Cette observation démontre que la diminution de la stabilité thermodynamique de BlaP216(Gln)79 n'est pas le seul facteur responsable de sa propension élevée à s'agréger. Elle met aussi en évidence la complexité du processus d'agrégation des protéines polyQ et l'importance de l'influence des régions non-polyQ dans le mécanisme de formation des fibres amyloïdes provoquée par l'expansion polyQ. L'ensemble de ces résultats suggère que les anticorps ou fragments d'anticorps dirigés contre les régions non-polyQ des protéines polyQ associées aux maladies pourraient constituer une stratégie thérapeutique pertinente. Ils démontrent également l'intérêt des VHH ou nanobodies comme sondes pour obtenir une meilleure connaissance des mécanismes sous-jacents à la formation de fibres amyloïdes.
Les expériences préliminaires de protéolyse limitée et de transglutamination suggèrent que les séquences polyQ sont toutes flexibles, excepté celle de 23 glutamines insérée en position 197 de BlaP qui semble plus rigide que les autres. Les résultats obtenus confirment que, globalement, la structure de BlaP n'est pas significativement modifiée par les insertions tandis que les chimères 216 semblent plus dynamiques que les chimères 197.
