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Abstract :
[fr] Les norovirus sont des agents majeurs de gastroentérite humaine d’origine alimentaire et ceci à travers le monde entier. La contamination est habituellement oro-fécale. Les norovirus sont non enveloppés et ont un génome composé d’ARN monocaténaire de polarité positive d’approximativement 7,5 kb. Au sein de ce génome, trois cadres ouverts de lecture (ORFs) sont décrits. L’ORF 1 code pour une polyprotéine qui sera par la suite clivée pour donner les différentes protéines non-structurales. L’ORF 2 encode pour l’unique protéine de capside. Une protéine structurale mineure dont le rôle est encore peu caractérisé est encodée par l’ORF 3. Ces virus sont très résistants dans l’environnement et une infection peut survenir même avec une très faible dose infectieuse. Appartenant à la famille des Caliciviridae, le genre norovirus est composé de cinq génogroupes (G) et contient également des virus infectant les animaux (bovins, porcins, murins). L’impact des norovirus animaux et plus particulièrement des norovirus bovins peut être envisagé à travers un possible caractère zoonotique de ces virus ; ainsi ils pourraient par exemple être transmis à l’homme via des eaux d’effluent contaminées.
L’étude des norovirus humains et bovins est encore à l’heure actuelle entravée par l’absence d’un système de culture cellulaire. Cependant différents systèmes d’expression protéique ont été utilisés afin d’exprimer la protéine de capside, celle-ci s’assemblant spontanément avec d’autres pour reformer des pseudoparticules virales ou virus-like particles (VLPs). Ces VLPs sont morphologiquement et antigéniquement semblables aux virus natifs. Le but de ce travail était dans un premier temps d’obtenir des VLPs de souches humaines et bovines.
Les gènes codant pour la protéine de capside d’une souche humaine (H384) et d’une souche bovine (B309) ont été amplifiés par RT-PCR à partir d’échantillons de matières fécales collectés dans des laboratoires de diagnostic humain et vétérinaire. Ces gènes ont été séquencés et comparés grâce à des outils informatiques (Basic Local Alignment Search Tool, BLAST) à la banque de séquences déjà disponibles sur le site du NCBI. Nous avons pu déterminer que la séquence de capside de la souche H384 était proche de celle de la souche HuNV/Altenkirchen 140/01/DE, une souche de GII et de génotype 4 tandis que la séquence de la souche B309 était proche de celles de GIII et de génotpe 2 (groupe Newbury2). Des plasmides contenant les séquences des ORFs 2 de deux souches de norovirus humains de référence, la souche de Norwalk (GI) et celle de Hawaii (GII), ont été aimablement fournies par le Docteur Jan Vinjé (CDC, Atlanta, USA). Le système d’expression protéique baculovirus (Invitrogen) a été utilisé pour obtenir des VLPs. Brièvement, des cellules d’insecte des lignées Sf9 et H5 ont été infectées avec des baculovirus recombinants pour la protéine de capside des norovirus. Les VLPs ont été purifiées à partir des surnageants par ultracentrifugation sur un coussin de sucrose à 30% suivie d’une ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium. Ce gradient a été fractionné et les différentes fractions ont été analysées pour la présence de la protéine de capside des norovirus par SDS-PAGE. Pour vérifier que les fractions positives contenaient bien des VLPs, les surnageants ont été observés en microscopie électronique. Nous avons ainsi obtenu des VLPs de norovirus de trois des cinq génogroupes décrits (GI, II et III). Ces VLPs ont été utilisées pour immuniser des souris afin de produire des anticorps monoclonaux et pour immuniser des lapins afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Nous avons pu aussi tester une banque de sérums bovins par ELISA pour la présence d’anticorps dirigés contre les souches de norovirus de génogroupe III et de génotype 2, les plus fréquemment mises en évidence au sein de notre banque de matières fécales bovines.
