Optimalisation d’une RT-PCR en temps réel pour la détection du virus de l’hépatite A

En Belgique, l’incidence de l’hépatite A (HAV) est de 1,2 cas pour 100000 habitants. La population présente une faible immunité contre le HAV puisque seulement 50 % de la population possèdent des anticorps anti-HAV après l’âge de 30 ans. Ainsi un grand nombre d’individus reste susceptible de contracter une infection par le HAV.
Les sources de contamination sont principalement le contact de personne à personne mais aussi la consommation d’aliments (crus ou « ready-to-eat) contaminés. Cette contamination peut provenir de l’eau d’irrigation pour les fruits et légumes, de l’eau de mer pour les mollusques bivalves ou de la manipulation de l’homme lors des différentes étapes entre la récolte et la vente du produit. Dans ce projet, une nouvelle RT-PCR spécifique pour la détection du HAV est développée et évaluée.

Pour choisir de nouvelles amorces et sondes, des alignements sont réalisés avec les séquences de 19 souches de HAV (DNASTAR Lasergene) afin de cibler les régions les plus conservées du génome du HAV. Cinq nouveaux couples d’amorces ciblant plusieurs régions hautement conservées du génome de HAV ont été sélectionnés et testés à différentes températures d’hybridation et différentes concentrations en utilisant un agent se liant à l’ADN double brin (SYBR Green).
Une sonde fluorescente, de type FAM, spécifique de l’amplicon délimité par le couple d’amorces fournissant les meilleurs résultats a été dessinée et utilisée avec la technologie d’hydrolyse de sonde à deux concentrations différentes.
Des dilutions d’un facteur 10 de la suspension de la souche HM175 (HAV) ont été testées par le couple d’amorces et la sonde choisit pour établir ainsi une limite de détection.
La spécificité du couple d’amorce choisit a été testé en présence de différents picornavirus et virus entériques et de 3 génotypes de HAV (IA, IB et IIIA).
Le plasmide Sybricon019 et ses amorces spécifiques ont été utilisés comme contrôle interne d’amplification (IAC).
Un contrôle positif a aussi été créé afin de s’assurer du fonctionnement correct de la PCR en temps réel.

Parmi les 5 couples d’amorces sélectionnés, le couple HAV-F2/HAV-R2 permet d’obtenir les valeurs de Ct les plus faibles avec une concentration optimale de 300nM pour les amorces sens et anti-sens.
Ce couple d’amorces cible la région VP1/VP3 du génome du HAV. Différentes températures d’hybridation ont été testées et la température la plus élevée (60°C) a été sélectionnée pour limiter le risque d’amplification aspécifique. Pour augmenter la spécificité, une sonde, HAV P2, spécifique de l’amplicon délimité par les amorces HAV-F2 et HAV-R2, est utilisée à la concentration de 250nM.
Des dilutions d’un facteur 10 d’une suspension de HAV, 107 à 101 particules infectieuses par ml (déterminées par TCID50), donnent respectivement des valeurs de Ct de 19,2 à 38,4 et les dilutions de 100 à 10-2 particules infectieuses par ml ne donnent aucune amplification. La limite de détection est donc de 10 particules infectieuses par ml.
La spécificité des amorces et de la sonde pour la détection du HAV est correcte puisque les trois génotypes de HAV, IA, IB et IIIA, ont été détectés alors que les différents picornavirus et virus entériques n’ont donné aucun signal fluorescent d’amplification.

L’optimalisation d’un nouveau couple d’amorce et d’une sonde (HAV-F2, -R2 et -P2) ciblant une région hautement conservée du génome permet de détecter le virus HAV par RT-PCR. La région ciblée (VP1/VP3) diffère de la plupart des méthodes de détection de HAV par PCR en temps réelle décrites à ce jour. La seconde étape consiste à réaliser une série de tests dans différentes matrices alimentaires à risque (fruits de mer, fruits et légumes crus) dans le but de détecter des échantillons naturellement contaminés par le HAV.