Abstract :
[fr] Les antibiotiques, et notamment les antibiotiques à noyau β-lactame, ont révolutionné la médecine du 20ième siècle, et sauvé un nombre incalculable de vies. Leur efficacité est cependant mise en péril par la dissémination croissante des facteurs de résistance. La production de β-lactamases par des souches infectieuses est le principal mode de résistance aux antibiotiques à noyau β-lactame. Ces enzymes hydrolysent le noyau β-lactame de ces antibiotiques, les empêchant ainsi d’exercer leur action lytique. Parmi les β-lactamases, les métallo-β-lactamases (MβLs) attirent plus particulièrement l’attention en raison de leur capacité à hydrolyser les carbapénèmes, antibiotiques considérés comme les plus efficaces, et parce qu’il n’existe à l’heure actuelle aucun inhibiteur utile d’un point de vue clinique.
Avec ce travail, nous avons voulu explorer le potentiel des Nanobodies (Nbs) de camélidé en tant qu’inhibiteurs de β-lactamases, et plus particulièrement de MβLs. Ces fragments d’anticorps correspondent aux domaines variables des anticorps à chaîne lourde produits par les camélidés (HCAbs). Aussi appelés VHHs, ou « single-domain antibodies » (sdAbs), ils sont considérés comme les plus petits fragments fonctionnels dérivés d’anticorps, et peuvent être facilement sélectionnés par phage-display.
Des lamas et un dromadaire ont donc été immunisés avec la MβL VIM-4, ainsi qu’avec d’autres β-lactamases choisies comme modèles. Une sélection par phage-display nous a permis d’identifier un Nb inhibiteur de VIM-4, i.e. le Nanobody Nb_VIM38. Ce Nb a été fusionné à la protéine « cherry » pour augmenter sa production. Des concentrations de l’ordre du μM en cherry-NbVIM_38 inhibent l’hydrolyse de toutes les β-lactamines testées. Par ailleurs, un modèle d’inhibition mixte hyperbolique à tendance anticompétitive est proposé. L’épitope de NbVIM_38 a pu être déterminé par immunodétection en faisant usage de peptides chevauchants. Etant donné que le site de fixation de cherry-NbVIM_38 est distant du site actif, ce Nb peut être considéré comme un inhibiteur allostérique de la MβL VIM-4, et de probablement toutes les MβLs de type VIM. Notre hypothèse est que sa fixation interfère avec la dynamique de la boucle L7 du site actif.
L’inhibition de la MβL BcII par le Nanobody cAbBcII10 a aussi été étudiée. Ce Nanobody a été obtenu par K. Conrath et al. en 2001. Il a une affinité de l’ordre du nM pour la MβL BcII (« tight-binding »), ce qui devrait être pris en compte si une caractérisation détaillée de l’inhibition devait être réalisée. De manière surprenante, l’inhibition observée est partielle et dépendante du substrat, ce qui suggère un modèle d’inhibition mixte. Ce Nb peut probablement aussi être considéré comme un inhibiteur allostérique.
Ces Nanobodies illustrent la possibilité d’une inhibition allostérique des MβLs. Cette piste mériterait peut-être d’être explorée.
