Abstract :
[en] Epizootic rabbit enteropathy (ERE) is a pathology of the digestive system inducing economic
loss in rabbit husbandry throughout Europe. The aetiological agent is unknown at the present time
but a reference inoculum (TEC4) reproduces the pathology. This inoculum contains an extremely rich
bacterial flora. Several methods were used to reduce this bacterial flora while retaining virulence:
centrifugation on discontinuous sucrose gradient, cellular adherence and treatment with
chloroform/ethanol, antibiotics and an acid buffer. The flora of the obtained fractions were analyzed
using traditional bacteriological techniques: identification of cultivable species, counting of colony
forming units (CFU) and direct bacterioscopic exam after Gram coloration.
Then, molecular biology was used to compare inocula, fractions and negative control. Three
methods were used to find sequences present in virulent inocula and absent from non virulent
inocula and negative controls. Twenty-two restriction enzymes were used to compare the 16SrDNA
restriction profile (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis or ARDRA). Hypervariable regions
V3 and V6 to V8 were studied by Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Finally, Random
Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) was used on the inocula, fractions and negative controls.
Only the RAPD allow the obtainment of sequences specific to virulent inoculum. Unfortunately, a
study on field samples did not confirm the link between the sequences and ERE. For one of the two
identified sequences, a bacterial strain carrier was isolated. The strain was inoculated into rabbits but
no clinical signs of ERE were observed.
Samples of stools, blood and serum were collected during an experimental ERE infection. The
evolution of fecal bacterial flora was studied using DGGE to follow the evolution of flora over the
course of the disease. Unfortunately, neither specific bands nor specific band patterns appeared to
be linked to the disease. Seven bacterial species were detected in the blood samples of three
inoculated rabbits at day two post inoculation, confirming the hypothesis that bacteriemia occurs
early on ERE infection.
Finally, six fractions were analysed by pyrosequencing of the 16SrDNA gene. The aim was to
find one or several species present in the virulent inocula but absent or less numerous in the nonvirulent inocula and control. The richness and diversity of all the inocula is equal or superior to
human feces. As expected, the flora identified by pyrosequencing was different from the cultivable
flora. However, no genera or species was specifically linked to the virulent inocula. The resolution of
this technique was inadequate to identify the aetiological agent of ERE. A higher number of samples
and sequences could at best restrain the identification to one genus.
[fr] L’entéropathie épizootique du lapin (EEL) est une pathologie digestive induisant d'énormes pertes économiques pour la cuniculture européenne. L’agent étiologique reste inconnu à ce jour mais un inoculum de référence (TEC4) permet de reproduire la pathologie. Cet inoculum contient un trop grand nombre d'espèces bactériennes différentes pour permettre une analyse moléculaire directe. Il a donc été traité par centrifugation sur gradient de sucrose, par adhérence cellulaire, par ajout de chloroforme / éthanol, d’antibiotiques et d’un tampon acide, afin de réduire le nombre d'espèces bactériennes n'ayant pas de lien étiologique direct avec l'EEL. Ces différentes fractions ont été inoculées à des lapins exempts d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS) afin de vérifier leur virulence. Leur flore bactérienne a été analysée par des techniques de bactériologie classique à savoir : l’identification des espèces cultivables sur des milieux traditionnels, le dénombrement des Unités Formant Colonie (UFC) et un examen bactérioscopique direct après coloration de Gram afin de dénombrer les bactéries morphologiquement différentes.
Des techniques de biologie moléculaire ont été utilisées sur l’inoculum, ses fractions et des témoins négatifs. Le but était de trouver une séquence génomique spécifique à savoir une séquence, présente dans les fractions reproduisant la pathologie et absente de celles ne la reproduisant pas. Trois méthodes moléculaires ont été employées pour comparer les fractions positives et négatives. Une analyse des profils de restriction du gène 16SrDNA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ou ARDRA) a été effectuée au moyen de 22 enzymes de restriction. Les régions hypervariables V3 et, V6 à V8 du gène 16SrDNA ont été étudiées par Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Des PCR aléatoires (Random Amplification of Polymorphic DNA ou RAPD) ont également été effectuées. Seule cette dernière technique a permis la mise en évidence de séquences d’intérêt. Malheureusement une analyse de la fréquence de ces séquences sur des échantillons de terrain n’a pas permis la mise en évidence d’un lien étiologique avec l’EEL. Pour la première séquence, la souche bactérienne porteuse a pu être isolée. Aucun signe clinique d’EEL n’a pu être reproduit dans une épreuve virulente sévère. Des échantillons de matières fécales, de sang sur EDTA et de sérum ont été récoltés lors d’une reproduction expérimentale d’EEL sur lapins sensibles. Une étude de l’évolution de la flore fécale de lapins inoculés et non inoculés au cours du temps a été réalisée grâce à des profils de DGGE. Malheureusement, aucune bande spécifique ni aucun motif de bande ne semble lié à la présence de la pathologie. Sept espèces bactériennes ont été détectées dans les prélèvements de sang réalisés deux jours après inoculation chez trois lapins malades. Ceci confirme l’hypothèse d’une bactériémie en phase précoce d’EEL.
Enfin, six fractions ont été analysées par un pyroséquençage du gène 16SrDNA. Le but était de mettre en évidence un genre ou une espèce présents dans les fractions virulentes, moins nombreux dans la fraction peu virulente et absent de la fraction non virulente. La richesse et la diversité des échantillons est égale voire supérieur à celle d’échantillons de matière fécale humaine ou de sol. Comme il fallait s’y attendre, les genres identifiés par cette technique sont différents de ceux obtenus par culture, néanmoins aucun genre particulier ne semble lié aux échantillons virulents. La résolution de ce type d’analyse (souvent limitée au genre) semble insuffisante pour identifier l’agent directement ; néanmoins, un nombre plus élevé de séquences et d’échantillons pourrait permettre de réduire à un genre ou une famille la recherche de l’agent étiologique.
