Abstract :
[en] Avian primordial germ cells (PGCs), can keep their germ cells properties and are foreseen as promising tools for developing avian transgenesis and preservation of genetic resources of endangered species. We have developed original methods that allow long term (20 month) expansion of primary cultures of undifferentiated PGCs and their efficient cryopreservation.
Blood samples were collected from stage 13-18 embryos, pooled, deposited in cell culture inserts and co-cultivated in the presence of irradiated BRL cells. This physically separated co-culture system along with selective culture medium promoted emergence, selection and proliferation of undifferentiated PGCs lines. Overall, 35% of blood samples gave rise to PGCs cell lines originating from three commercial layer breeds and two Belgian endangered breeds. PGCs lines were first characterised for the expression of the stem cells and PGCs characteristic marker SSEA-1 by FACS (expression rate: 90-99%). RT-PCR confirmed expression of germ-line specific markers (CVH, CDH, DAZL), pluripotency markers (cPouV, cSox2, cNanog), telomerase and CXCR4 receptor. In addition, by means of a quantitative PCR amplification of a chromosome W specific sequence, we demonstrated a drift of all our lines towards the male sex (WL), while they were initially isolated from pooled blood samples with statistically equivalent numbers of male and female embryos (35 females: 29 males). PGCs were subsequently efficiently cryopreserved by slow freezing or by a newly developed vitrification method. Labelled PGCs from 10 lines were injected in recipient embryos. Colonization of the genital ridges confirmed that PGCs retain their gonadal migratory ability, both after long-term culture (min 3, max 20 month) and after cryopreservation.
[fr] Les cellules germinales primordiales (PGCs) aviaires ont la capacité de maintenir leur compétence germinale et constituent des cellules prometteuses pour une utilisation en transgénèse et comme moyen de préservation des ressources génétiques d’espèces menacées. Nous avons mis au point des systèmes de culture permettant l'expansion à long terme (20 mois) d'une culture primaire de PGCs indifférenciées et leur cryopréservation.Des prélèvements sanguins réalisés sur des embryons à des stades de développement compris entre 13 et 18 ont été poolés, déposés dans des inserts de culture et co-cultivés en présence de cellules BRL irradiées. Ce système de co-culture avec une séparation physique entre les PGCs et les feeder, auquel s'ajoute un milieu sélectif, permet l'émergence, le sélection et la prolifération de lignées de PGCs indifférenciées. 35 % des prélèvements ont donné naissance à des lignées de PGCs, dans 3 races commerciales de poules pondeuses mais aussi dans 2 races locales belges menacées.Les PGCs ont d’abord été caractérisées pour leur expression du marqueur propre aux cellules souches et aux PGCs, SSEA-1, par cytométrie en flux (taux d'expression: 90 à 99%). Une RT-PCR montre l’expression de marqueurs propres à la lignée germinale (CVH, CDH, DAZL), de marqueurs de pluripotence (cPouV, cSOX2, cNanog), de la télomérase et du récepteur CXCR4. A l'aide d'une technique de PCR quantitative basées sur l'amplification d'une séquence spécifique du chromosome W, nous avons démontré une dérive de toutes nos lignées vers le sexe mâle (WL), alors qu'elle ont été isolées à partir de prélèvements constitués à parts statistiquement égales de mâles et de femelles (35 femelles : 29 mâles). Par la suite, les PGCs ont été efficacement cryopréservées par congélation lente ou par une méthode de vitrification nouvellement développée. La colonisation des crêtes génitales montre que les PGCs ont conservé leur capacité de migration, que ce soit après culture à long terme (min 3, max 20 mois) ou après cryopréservation.
Disciplines :
Veterinary medicine & animal health
Anatomy (cytology, histology, embryology...) & physiology
Biotechnology
