Abstract :
[en] Polyglutamine (polyQ) diseases are characterized by the formation of intranuclear amyloid-like aggregates by proteins containing an expansion of a polyQ tract above a threshold length. These insoluble aggregates and/or some of their soluble precursors are thought to play a role in the pathogenesis of the diseases. The only known common point between the causative proteins is the expanded polyQ tract, suggesting that their aggregation critically depends on the expansion of the polyQ tract above a threshold length. Several studies have however shown that the non-polyQ regions can also influence the aggregation behavior of polyQ proteins. In this work, polyQ chimeras were created by inserting different polyQ lengths in two positions (197-198 and 216-217) of the β-lactamase BlaP from Bacillus licheniformis 749/C. The structural and thermodynamic properties of the polyQ chimeras as well as their aggregating properties under native and denaturing conditions were investigated using a range of biophysical techniques including fluorescence, circular dichroism, absorbance, x-ray fiber diffraction and transmission electron microscopy.
We have first created and characterized chimeras with 23, 30, 55 and 79Q inserted in position 197-198 (chimeras 197-198). None of these insertions modifies the structure of BlaP; they do, however, significantly destabilize the enzyme by 7.6-8.8 kJ/mol independently of the polyQ length. Similarly to the proteins associated with diseases, there is a threshold number of glutamines above which the BlaP chimeras aggregate into amyloid-like fibrils. It is comprised between 55 and 79Q and between 30 and 55Q under native and denaturing conditions, respectively. This threshold value therefore depends on the structural integrity of BlaP and thus on the steric and/or conformational constraints applied by BlaP to the polyQ tract.
We have then compared the properties of these chimeras with those of the chimeras containing polyQ of the same lengths in position 216-217 (chimeras 216-217). The tertiary structure of BlaP is slightly perturbed in the chimeras 216-217 and these chimeras are less stable than the chimeras 197-198. However, the urea-induced equilibrium unfolding experiments suggest that chimeras 216-217 populate a series of discrete intermediate states between the native and unfolded states or that their unfolded state significantly differs from that of chimeras 197-198. Finally, the aggregating properties of the polyQ chimeras 216-217 differ from those of chimeras 197-198. First, the threshold number of glutamines above which chimeras 216-217 readily form fibrils under native conditions (between 30 and 55Q) is lower than that observed for chimeras 197-198 (between 55 and 79Q) suggesting that the steric and/or conformational constraints imposed on the polyQ tract are lower when it is inserted in position 216-217. Secondly, the results obtained under both native and denaturing conditions indicate that the BlaP moiety could assist fibril formation by chimeras 216-217 while it has an inhibiting effect and no effect on fibril formation by the chimeras 197-198 with 55 and 79 glutamines, respectively.
Taken together, these results show that the aggregating properties of BlaP chimeras result from a very complex interplay between the propensity of the polyQ tract to mediate fibril formation and the modulating effect of the BlaP moiety. BlaP chimeras present therefore valuable models to investigate in details how the properties of the host protein influence the aggregation behavior of expanded polyQ proteins.
[fr] Les maladies à polyglutamine (polyQ) sont caractérisées par la formation d’agrégats intranucléaires de type amyloïde par des protéines contenant une expansion polyglutamine au-dessus d’une taille seuil. Ces agrégats insolubles et/ou certains de leurs précurseurs solubles pourraient jouer un rôle dans la pathogenèse de ces maladies. Le seul point commun connu entre les protéines impliquées est la présence d’un stretch polyQ étendu suggérant que leur agrégation est étroitement liée à l’expansion du polyQ au-dessus d’une taille seuil. Cependant, plusieurs études ont montré que les régions en-dehors des polyQ peuvent aussi influencer les propriétés d’agrégation des protéines à polyQ. Dans cette thèse, des protéines chimères ont été créées en insérant différentes tailles de séquences polyQ à deux positions (197-198 et 216-217) de la β-lactamase BlaP de Bacillus licheniformis 749/C. Les propriétés structurales et thermodynamiques de ces chimères ainsi que leurs propriétés d’agrégation en conditions natives et dénaturantes ont été étudiées en utilisant une série de techniques biophysiques dont la fluorescence, le dichroïsme circulaire, l’absorbance, la diffraction des rayons X par les fibres et la microscopie électronique à transmission.
Nous avons tout d’abord créé et caractérisé des chimères contenant 23, 30, 55 et 79Q en position 197-198 (chimères 197-198). Aucune de ces insertions n’affecte la structure de BlaP mais elles déstabilisent la protéine de 7,6-8,8 kJ/mol quelle que soit la longueur du polyQ. Similairement à ce qui est observé avec les protéines associées aux maladies, il existe un nombre seuil de glutamines au-dessus duquel les chimères de BlaP s’agrègent en fibres de type amyloïde. Ce seuil est compris entre 55 et 79Q en conditions natives et entre 30 et 55Q en conditions dénaturantes. La valeur de cette taille seuil dépend par conséquent de l’intégrité structurale de BlaP et donc des contraintes stériques et/ou conformationnelles exercées sur le stretch polyQ par BlaP.
Ensuite, nous avons comparé les propriétés de ces chimères avec celles de chimères contenant des séquences polyQ de mêmes longueurs en position 216-217 (chimères 216-217). La structure tertiaire de BlaP est altérée dans les chimères 216-217 et ces chimères sont moins stables que les chimères 197-198. Cependant, les expériences de dénaturation à l’équilibre par l’urée suggèrent que les chimères 216-217 forment une série d’états intermédiaires discrets entre les états natif et dénaturé ou que leur état dénaturé diffère significativement de celui des chimères 197-198. Finalement, les propriétés d’agrégation des chimères 216-217 diffèrent de celles des chimères 197-198. Premièrement, en conditions natives, le nombre seuil de glutamines au-dessus duquel les chimères 216-217 forment des fibres (compris entre 30 et 55Q) est plus faible que celui observé pour les chimères 197-198 (compris entre 55 et 79Q). Ce résultat suggère que les contraintes stériques et/ou conformationnelles exercées sur le stretch polyQ sont plus faibles lorsque celui-ci est inséré en position 216-217. Deuxièmement, les résultats obtenus en conditions natives et dénaturantes indiquent que BlaP pourrait assister l’agrégation en fibres des chimères 216-217 alors qu’il a un effet inhibiteur ou pas d’effet sur la formation de fibres par les chimère 197-198 contenant 55Q et 79Q, respectivement.
En conclusion, l’ensemble des résultats obtenus montrent que les propriétés d’agrégation des chimères de BlaP résultent d’un effet combiné complexe entre la propension du stretch polyQ à promouvoir la formation de fibres et l’effet modulateur de BlaP. Les chimères de BlaP sont donc de bons modèles pour étudier en détail comment les propriétés de la protéine hôte influencent les propriétés d’agrégation des protéines à expansion polyQ.
