Abstract :
[en] The research activities described in this Thesis were carried out in the Walloon Centre of Industrial Biology at the University of Liege. Laboratory experiments were performed with Citrobacter freundii CWBI952, a facultative anaerobe of the Enterobacteriaceae family, and Clostridium butyricum CWBI1009, a strict anaerobe of the Clostridium genus, to produce hydrogen by dark fermentation of glucose in flasks and in bench-scale bioreactors maintained at 30°C.
The aim of the research activities was not only to optimise the key determinants of H2 production, namely pH, nitrogen and iron concentrations, and the dilution rate, but also to gain a better understanding of the relatively unknown hydrogen production metabolism. This was done by monitoring the H2 production activity and tracking the net carbon and electron equivalent balances. The results for C. freundii CWBI952 (Chapter II) indicated that maximum hydrogen production activity, formate biosynthesis and glucose uptake rates were obtained at pH 5.9. Optimal overall performance (33.2 mLH2/L.h and 0.83 molH2/molglucose) was obtained in a semicontinuous culture with a dilution rate of 0.012 h-1. The best performance for C. butyricum CWBI1009 (Chapter V), i.e. 1.44 LH2/h and a yield of 2.02 molH2/molglucose, was associated with butyrate fermentation and obtained in a 20 L batch bioreactor at the optimal pH value of 5.2. For both of these strains we demonstrated that it should be possible to radically reduce nitrogen feedstock costs by replacing casein peptone with (NH4)2SO4, an ammoniacal substance closely related to the mineral nitrogen content of livestock manure. Additionally for C. butyricum CWBI1009 (Chapter III) we showed that a certain range of nitrogen content (0.56-0.062 gN/L) favours H2 production activity. This was confirmed by an analysis of the gene expression pattern, which suggested that the HydB2 gene was responsible for the H2 yield increase observed at 0.062 gN/L.
Our investigations provided a better understanding of the highly diversified H2-production metabolism of C. butyricum CWBI1009 by mapping the distribution pattern for its carbon and electron fluxes (Chapters IV and V). This was done using three complementary approaches to study the metabolome (HPLC RID-UV), transcriptome (RT-qPCR and RNAseq) and the proteome (2D-DIGE). Tests under various different pH conditions showed that the role played by the different hydrogenases and the nitrogenase in H2 production varied substantially depending on the particular environmental conditions.
At the end of the Thesis the discussion (Chapter VI) provides a general overview of the results obtained for the optimisation of the dark fermentation process parameters and an analysis of how these investigations have advanced our understanding of the metabolic processes involved. Potential industrial applications are reviewed and suggestions for further research are made.
[fr] Les recherches décrites dans cette Thèse ont été menées au Centre Wallon de Biologie Industrielle de l’Université de Liège. Deux bactéries (une souche anaérobie facultative de la famille des Enterobacteriaceae, Citrobacter freundii CWBI952, et une souche anaérobie stricte du genre Clostridium, Clostridium butyricum CWBI1009) ont été sélectionnées comme modèles pour produire de l’hydrogène. Les cultures ont été réalisées en fioles de 270 mL et en bioréacteurs de 2.3 et 20 L maintenus à 30 °C et avec le glucose comme substrat carboné.
L’objectif des travaux a été d’optimiser les déterminants clés de la production d’hydrogène, à savoir le pH, l’apport en azote et en fer, et le taux de dilution tout en contribuant à une meilleure compréhension du métabolisme des deux souches. Nous avons atteint cet objectif en effectuant le suivi, d’une part, des productivités et des rendements en H2 et, d’autre part, de la distribution des métabolites solubles et des équivalents électroniques en cours de culture. Les résultats obtenus avec C. freundii CWBI952 (Chapitre II) indiquent que l’activité maximale de production d’hydrogène, la biosynthèse de formiate et le taux de consommation du glucose sont favorisés à pH 5.9. Les meilleures performances pour cette souche (i.e. 33.2 mLH2/L.h et 0.83 molH2/molglucose) ont été obtenues en culture semi continue de 2.3 L à un taux de dilution de 0.012 h-1. Les meilleures performances pour C. butyricum CWBI1009 (Chapitre V), à savoir 1.44 LH2/h et 2.02 molH2/molglucose, ont été associées à la production de butyrate et obtenues en bioréacteur de 20 L au pH optimal de 5.2.
Pour ces deux souches, nous avons démontré qu’il doit être possible de réduire radicalement le coût de l’apport en substrat azoté en remplaçant la peptone de caséine par du (NH4)2SO4, une substance ammoniacale comparable au contenu en azote minéral des effluents d’élevage. De plus, pour C. butyricum CWBI1009 (Chapitre III), nous montrons qu’une certaine gamme de concentration en azote organique ou ammoniacal (0.56-0.062 gN/L) favorise l’activité de production d’hydrogène. Nous le confirmons par une analyse du profil d’expression des hydrogénases qui suggère que le gène HydB2 serait responsable de l’augmentation des rendements observé à 0.062 gN/L.
En outre, nos recherches ont fourni une meilleure compréhension du métabolisme de production d’H2 de C. butyricum CWBI1009 en cartographiant les flux de carbone et la distribution des électrons à l’aide de trois approches complémentaires pour étudier le métabolome (HPLC RID-UV), le transcriptome (RT-qPCR et RNAseq) et le protéome (2D-DIGE) de la souche (Chapitre IV et V). Des tests à différents pH (pH libre et pH fixe 5.2 et 7.3) ont mis en évidence que le rôle joué par les différentes hydrogénases et la nitrogénase lors de la production d’H2 varie de manière substantielle en fonction des conditions environnementales.
En fin de Thèse, la discussion (Chapitre VI) fournit une vision globale des résultats obtenus pour l’optimisation du bioprocédé ainsi qu’une meilleure compréhension des processus métaboliques menant à la production d’H2 chez C. butyricum. Des applications industrielles pour les deux souches modèles sont également passées en revue ainsi que des perspectives de recherches plus étendues.
