Activité et modulation de la NADPH oxydase des neutrophiles équins: tests in vitro sur cellules entières et mise au point du dosage en "cell-free system"

Chez le cheval, la réponse inflammatoire causée par certaines pathologies (obstruction intestinale, fourbure,…) implique une stimulation excessive des polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) libérant de grandes quantités d’espèces activées de l’azote et de l’oxygène (RNOS). La première enzyme impliquée dans la formation de ces espèces activées est la NADPH oxydase, produisant l’anion superoxyde (O2.-) d’où dérivera la formation de diverses RNOS. Actuellement, la NADPH oxydase est considérée comme une cible privilégiée pour la modulation de l’inflammation excessive. Le but de ce travail a été d’étudier l’effet de molécules modulant la réponse inflammatoire (la curcumine, la quercétine et l’acépromazine : ACP) ou l’activité de la NADPH oxydase (le diphénylène iodonium : DPI) sur la production de RNOS par les PMNs stimulés. L’étude a été menée sur des PMNs équins isolés où la production de RNOS a été mise en évidence par trois techniques différentes : la chimiluminescence assistée par la lucigénine et la réduction du ferricytochrome C, ciblant essentiellement la production d’O2.- ; et une technique de fluorescence utilisant la 2’,7’-dichlorofluorescine-diacétate (DCFH-DA), ciblant la production intra et extracellulaire de RNOS. L’effet de ces molécules a pu être testé de façon plus spécifique sur la NADPH oxydase par une mesure en « cell-free system » que nous avons mise au point et consistant en la reconstitution in vitro de la NADPH oxydase. Nous avons constaté que les molécules polyphénoliques testées (quercétine et curcumine) agissaient surtout comme des antioxydants stoechiométriques en neutralisant les RNOS intracellulaires et extracellulaires sans pour autant être des inhibiteurs de la NADPH oxydase. Nous avons également démontré que certaines molécules (l’ACP et le DPI) utilisées à forte concentration pouvaient amplifier la réponse oxydante des PMNs. Enfin, grâce à la technique du « cell free system » nous avons démontré, pour la première fois, l’effet anti-catalytique du DPI sur la NADPH oxydase équine. La complémentarité de ces techniques permettra de faire la distinction entre un effet antioxydant, pro-oxydant ou anti-catalytique d’une molécule biologique pouvant moduler la réponse inflammatoire. Enfin, ce travail présente les premiers résultats de l’isolement des sous-unités membranaires de la NADPH oxydase équine. Les résultats sont encourageants et la purification à plus long terme du complexe enzymatique entier avec la production d’anticorps spécifiques devrait permettre la mise au point d’un dosage original de la NADPH oxydase consistant en l’immuno-capture de l’enzyme active afin de cibler l’effet de substances biologiques sur son assemblage et son activité spécifique.