Reference : Origine et effet de la myéloperoxydase lors de la congélation du sperme d'étalon
Dissertations and theses : Doctoral thesis
Life sciences : Biochemistry, biophysics & molecular biology
Life sciences : Biotechnology
Life sciences : Veterinary medicine & animal health
http://hdl.handle.net/2268/114349
Origine et effet de la myéloperoxydase lors de la congélation du sperme d'étalon
French
[en] Origin and effect of myeloperoxidase during stallion semen freezing
Ponthier, Jérôme mailto [Université de Liège - ULg > Département clinique des animaux de compagnie et des équidés > Anesthésiologie gén. et pathologie chirurg. des grds animaux >]
28-Mar-2012
Université de Liège, ​Liège, ​​Belgique
Doctorat en Sciences Vétérinaires, Orientation Médecine Vétérinaire
115+131
Deleuze, Stefan mailto
Hanzen, Christian mailto
Serteyn, Didier mailto
Franck, Thierry mailto
Gillet, Laurent mailto
Grulke, Sigrid mailto
Magistrini, Michèle mailto
Bruyas, Jean-François mailto
Beckers, Jean-François mailto
Antoine, Nadine mailto
Bureau, Fabrice mailto
Ectors, Fabien mailto
[en] Horse ; Stallion ; Semen ; Spermatozoa ; Cryopreservation ; Freezing ; Reactive oxygen species ; Myeloperoxidase ; Non-sperm cells ; Oxidative stress ; Freezability
[en] Semen freezing allows worldwide commercialization of equine genetic. Despite improvement of techniques, semen of 20% of stallions remains unfreezable. Currently, post-thaw semen quality is only determined by progressive motility, but its definition is not standardised. Spermatozoa are highly differentiated cells and freezing lesions can occur on DNA, membrane, mitochondria or acrosome. Current research focuses on prediction of freezability, improvement of freezing extenders and prevention of Reactive Oxygen Species (ROS) effects. Under its O2 form, oxygen is inactive and oxidase or oxygenase enzymes are required to produce ROS. Two pathways of ROS production in semen are described: the intrinsic pathway reflecting ROS escaping from the spermatozoon mitochondria and the extrinsic pathway corresponding to ROS produced by inflammatory cells. ROS induce DNA fragmentation, lipid peroxidation, apoptosis and decreased motility of spermatozoa. Myeloperoxidase (MPO) is a pro-oxidant enzyme contained in and released by neutrophils during degranulation or after lysis. It is responsible for formation of hypochlorous acid, a strong oxidant, which could damage spermatozoa. However, MPO presence and effects have never been investigated in equine semen.
The first aim was to assay presence of MPO in equine thawed semen and to determine a relation between MPO concentration and post-thaw semen parameters. 35 straws from different stallions were analyzed. Post-thaw spermatozoa and MPO concentrations, viability, morphology, progressive and total motility were determined. Our study showed that thawed semen contains large amounts of free MPO. High MPO concentration samples showed lower total and progressive motility. Higher proportion of acrosome reaction was observed in late examinations of the high MPO concentration group.
As MPO was present in frozen semen and did interfere with its quality, timing and origin of its release was determined during the freezing process. Forty ejaculates were frozen with a classical procedure. MPO ELISA and MPO immunocytochemistries (ICC) were assayed in raw semen, centrifugation supernatant, and after cooling down to 4°C. Post-thaw MPO concentration and spermogram parameters were determined. MPO concentration increased after cooling and thawing when compared to fresh semen. As temperature decreased, MPO was higher in post-thaw poor quality samples. Non-sperm cells (NSC) showed various degrees of MPO-ICC, and were mostly epithelial cells with nuclear picnosis. Elastase, another neutrophil pro-inflammatory enzyme, was also assayed in post-thaw semen. In twenty ejaculates, NSC concentration was determined in fresh semen. Post-thaw motilities were determined by CASA; MPO and elastase concentrations were assayed by ELISA. Post-thaw elastase concentrations were low and there was no difference according to semen quality. NSC or MPO concentrations were not correlated to elastase concentration. NSC concentration was higher in unfreezable semen and correlated to post-thaw MPO concentration.
To confirm MPO release by NSC during freezing, the effect of washing semen with density gradient centrifugation (DGC) was then assayed on NSC and MPO concentrations. NSC and MPO concentrations were assessed at each step and MPO localization was performed by ICC. DGC washing decreased NSC and MPO concentrations in post-thaw semen and NSC were mainly remaining in DGC supernatant. MPO concentration was correlated with NSC concentration in the upper layer of the DGC supernatant and in post-thaw semen. NSC were epithelial cells showing MPO-ICC staining.
Fresh semen MPO concentration had no effect on fresh or post-thaw semen quality, while post-thaw semen concentrations were correlated with decreased motility. To understand these findings, concentration, activity and structure of MPO present in seminal plasma, sperm-rich pellet and post-thaw semen were assayed. Factor inducing MPO release was determined by adding or not glycerol in samples stored at 4°C or 20°C. Total MPO was high in seminal plasma and thawed semen and low in sperm-rich pellet. Active MPO was high in sperm-rich pellet and low in seminal plasma and post-thaw semen. MPO concentrations were correlated in post-thaw and in semen cooled at 4°C with or without glycerol. Active MPO in sperm-rich pellet and post-thaw progressive motility were highly negatively correlated. MPO present in fresh semen is mainly the native inactive enzyme subunit.
To confirm our previous findings, effect of active MPO and fresh or frozen-thawed NSC was assayed on purified spermatozoa motility, mitochondrial potential, membrane and acrosome integrity. Highest MPO concentration tested (50ng/ml) decreased motility. However, highest MPO concentration did not affect mitochondrial potential, membrane or acrosome integrity. Thawed NSC did decrease motility and mitochondrial potential when compared to fresh NSC, suggesting a synergic effect between MPO and other products released by NSC after thawing.
Temperature decrease during freezing process increases MPO concentration and post-thaw concentration is negatively associated to post-thaw motilities. ICC slides have shown MPO presence on epithelial keratinized and pycnotic cells while neutrophils were rarely observed. Semen washing with DGC decreases MPO and NSC concentrations in post-thaw semen as NSC and MPO concentrations were positively correlated. MPO present in seminal plasma is native and inactive form while MPO present in sperm-rich pellet is active and negatively correlated to the post-thaw progressive motility. Addition of active MPO in semen decreased motility but had no effect on acrosome integrity, despite what had previously been suggested. Thawed NSC addition to spermatozoa decreased mitochondrial potential, suggesting a synergic effect between MPO and other factors released by NSC.
Further studies should investigate the origin of high inactive MPO concentrations in fresh semen. Other studies should be conduced about the origin of epithelial keratinized pyknotic NSC in fresh semen and the pathophysiological mechanism leading to their MPO release during freezing. Large scale studies should be conducted to confirm the use of NSC concentration in fresh semen or active MPO concentration in sperm rich pellet as freezability prognosis. Further studies should also investigate effect of MPO specific inhibitors.
[fr] La congélation du sperme équin a permis la commercialisation internationale du sperme. Cependant, malgré les améliorations techniques, 20% des éjaculats ont une qualité insuffisante en décongélation. Actuellement, la qualité du sperme congelé est uniquement définie sur base de la mobilité progressive observée en décongélation, même si les conditions d’analyse de ce paramètre ne sont pas standardisées. La congélation entraîne aussi des lésions de la membrane, de l’acrosome et des mitochondries. En andrologie, les recherches actuelles se focalisent sur la prédiction de la qualité en décongélation, sur l’amélioration des techniques et des milieux de congélation et sur l’effet des Formes Activées de l’Oxygène (FAO). Les FAO sont produites par des enzymes oxydantes car l’oxygène O2 est inactif à l’état naturel. Dans le sperme, il existe deux voies de production des FAO : les FAO issues des électrons s’échappant de la mitochondrie du spermatozoïde appartiennent à la voie intrinsèque et la voie extrinsèque caractérise les FAO produites par les cellules inflammatoires du sperme. Les FAO induisent la lipoperoxydation membranaire, la fragmentation de l’ADN, l’apoptose et une diminution de mobilité des spermatozoïdes. La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme prooxydante contenue et libérée par les Polymorphonucléaires Neutrophiles (PMN) lors de leur dégranulation ou de leur apoptose. La MPO est responsable de la formation d’acide hypochloreux, un oxydant puissant qui pourrait endommager le spermatozoïde. Cependant, la présence de MPO n’avait jamais été étudiée dans le sperme équin.
Une première étude a déterminé la présence de MPO dans le sperme congelé et a évalué l’association entre sa concentration (mesurée par ELISA) et la qualité du sperme après décongélation. L’étude a montré que de hautes concentrations en MPO étaient présentes dans le sperme congelé et que ces concentrations étaient négativement associées avec la mobilité progressive. La concentration en MPO pouvait donc indiquer la qualité du sperme congelé, mais uniquement a posteriori.
Afin de déterminer l’origine de la MPO au cours du processus de congélation, les concentrations en MPO totales ont été mesurées lors des 4 étapes de la congélation : sperme frais, surnageant du sperme frais, sperme réfrigéré et sperme décongelé. Pour localiser les cellules contenant de la MPO, des colorations ImmunoCytoChimiques (ICC) sur frottis ont été réalisées à chacune des étapes. Au cours du processus de congélation, une augmentation de la concentration en MPO a été constatée après réfrigération et décongélation malgré le retrait du surnageant du sperme frais riche en MPO. Les concentrations en MPO dans le sperme réfrigéré et congelé étaient associées à la mobilité progressive en décongélation. Les cellules non-spermatiques (NSC) étaient colorées par ICC pour la MPO et étaient presque uniquement représentées par des cellules de type épithélial à noyaux pycnotiques ou anucléés. Dans un protocole annexe, l’élastase, une enzyme libérée par les mêmes granules du PMN, a été dosée (ELISA) dans le sperme congelé équin. Ses concentrations étaient faibles et non-associées à la concentration en MPO ou à la mobilité. Dans ce protocole, une association a été observée entre la concentration en NSC dans le sperme frais, la concentration en MPO et la mobilité en décongélation, ce qui procurait un facteur pronostique de la qualité en décongélation.
Pour confirmer que la MPO était libérée par les NSC au cours de la congélation, celles-ci ont été séparées par des méthodes de centrifugation en gradient de densité (Density Gradient Centrifugation, DGC) avant congélation. La concentration en MPO totale était mesurée (ELISA) et la localisation cytologique était déterminée par ICC sur frottis. Après séparation par DGC les concentrations en NSC et MPO étaient diminuées dans le sperme congelé. Les concentrations en MPO et NSC étaient corrélées dans le sperme congelé et dans les surnageant ayant séparé les NSC. Les NSC étaient spécifiquement immunocolorées pour la MPO. Ces données montraient que les NSC libéraient de la MPO au cours de la congélation.
Au cours des études précédentes, la concentration en MPO dans le sperme frais n’avait aucun effet sur la qualité du sperme frais alors que les concentrations en MPO dans le sperme congelé étaient négativement associées à la mobilité observée après décongélation. Pour comprendre ces observations, la concentration (ELISA) et l’activité (SIEFED) de la MPO ont été déterminées dans le surnageant du sperme frais, dans le culot cellulaire du sperme frais et dans le sperme congelé. Les sous-unités de l’enzyme présentes dans les échantillons ont aussi été déterminées. Dans le surnageant du sperme frais, la concentration en MPO était élevée, mais l’activité était basse car le précurseur inactif de la MPO était majoritairement présent. Dans le culot cellulaire qui est utilisé pour la congélation, malgré une concentration en MPO totale relativement basse, l’activité était plus élevée. L’activité de la MPO présente dans le culot cellulaire était fortement associée à la mobilité observée en décongélation, en faisant un pronostic de la qualité du sperme congelé. Les concentrations en MPO observées dans le sperme congelé étaient augmentées par rapport au culot cellulaire, mais l’activité était fortement diminuée, le milieu de congélation faisant perdre 75% de l’activité de la MPO.
Pour confirmer les effets observés, des solutions contenant de la MPO, des NSC fraîches ou congelées ont été ajoutées à du sperme frais. La plus haute concentration en MPO a diminué la mobilité mais n’a pas eu d’effet sur le potentiel mitochondrial, l’intégrité membranaire ou acrosomiale. Les NSC congelées ont diminué la mobilité et le potentiel mitochondrial, suggérant une synergie de la MPO et des NSC pour provoquer des lésions spermatiques.
En conclusion, de la MPO majoritairement inactive est présente dans le sperme frais et elle est retirée lors de la centrifugation. Lors de la réfrigération et de la congélation, les NSC du culot cellulaire libèrent de la MPO inactive et active. L’addition de MPO active purifiée ou de NSC congelées à du sperme a confirmé ces observations. Les NSC sont représentées par des cellules épithéliales immunomarquées à la MPO et non des PMN. La concentration en NSC dans le sperme frais et en MPO active dans le culot cellulaire frais pourraient être des facteurs pronostiques de qualité après décongélation. Le mécanisme physiopathologique menant à la présence de MPO sur les NSC et le processus de desquamation de ces dernières devraient être décrits afin de déterminer les meilleures stratégies d’inhibition de la voie de production de FAO associée à la congélation.
Centre de l’Oxygène, Recherche et Développement - CORD ; Centre européen du cheval (LINALUX - MONT LE SOIE) ; ULg - FMV - Département des Sciences cliniques - Pôle équin - Obstétrique et pathologies de la reproduction des équidés et carnivores domestiques
ULg - FMV - Département des Sciences cliniques - Pôle équin - Obstétrique et pathologies de la reproduction des équidés et carnivores domestiques ; ULg - FMV - Département des Sciences cliniques - Pôle équin
SPERMPO
Researchers ; Professionals ; Students
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