Reference : Évaluation de l’impact de l’extrapolation de bioréacteur sur la physiologie de Yarrow...
Dissertations and theses : Doctoral thesis
Physical, chemical, mathematical & earth Sciences : Chemistry
http://hdl.handle.net/2268/110832
Évaluation de l’impact de l’extrapolation de bioréacteur sur la physiologie de Yarrowia lipolytica pour la production de lipase
French
Kar, Tambi mailto [Université de Liège - ULg > > > Doct. sc. agro. & ingé. biol.]
2-Feb-2012
university of liege, ​Gembloux, ​​Belgium
Dissertation originale présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en sciences agronomiques et ingénierie biologique
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Thonart, Philippe mailto
Delvigne, Frank mailto
Lognay, Georges mailto
Bera, François mailto
Sindic, Marianne mailto
Lebeau, Frédéric mailto
mgalleni, Moreno mailto
Fickers, Patric mailto
Destiné, Jacques mailto
[fr] Yarrowia lipolytic ; lipase ; extrapolation
[fr] Les travaux entrepris au cours de cette thèse visent à mettre en place une méthodologie globale d’extrapolation de bioréacteurs. Le procédé de production de lipase par Yarrowia lipolytica a été plus particulièrement investigué, compte tenu de la complexité du système biologique et des paramètres physico-chimiques mis en œuvre. En effet, ce procédé met en œuvre une levure dite non conventionnelle dans un réacteur multiphasique G-L-L comprenant un substrat hydrophobe (le méthyloléate étant utilisé comme source de carbone renouvelable). Du fait du caractère strictement aérobie de ce type de levure, le transfert d’oxygène est un paramètre critique pour ce procédé. Dans un premier temps, l’ensemble des paramètres physico-chimiques clés du procédé ont été investigués (c’est-à-dire la dispersion du méthyloléate, les fluctuations en oxygène dissous et en pH). Cette évaluation a été menée en se basant sur des paramètres physico-chimiques (mélange du réacteur, transfert d’oxygène,…), mais également sur base de paramètres biologiques (synthèse et excrétion de la lipase, activation du gène lip2,…). Cette première étude a démontré que le paramètre critique était la fluctuation de l’oxygène dissous, ce paramètre menant à une réduction du rendement spécifique en lipase, liée à une atténuation de l’activité du gène lip2 codant pour la lipase extracellulaire de Y. lipolytica. Ce paramètre est d’autant plus important que les amplitudes des fluctuations en oxygène dissous sont amplifiées lors du processus de montée en échelle pour l’extrapolation du procédé. L’efficacité de dispersion du substrat hydrophobe (méthyloléate) au sein du milieu aqueux ne semble pas avoir d’impact sur l’efficacité du procédé, la levure sécrétant un biosurfactant permettant de stabiliser la dispersion. Les fluctuations en pH ont également peu d’impact sur le rendement de production de lipase, mais des observations au microscope ont révélé un début de dimorphisme cellulaire. Cette observation démontre la complexité de la réponse du système biologique face aux conditions de procédé. L’impact des fluctuations en oxygène dissous sur l’activité du gène lip2 a été confirmé par des analyses plus poussées en PCR quantitative (RT-qPCR). La deuxième partie du travail a donc été focalisée sur l’optimisation du transfert d’oxygène. Cette optimisation n’est pas triviale si on considère le phénomène de formation de mousse important lorsque la dispersion G-L au sein du réacteur est trop fine. Deux stratégies antimousse ont donc été envisagées : l’une mettant en œuvre l’ajout d’antimousse chimique et l’autre l’emploi d’un briseur de mousse mécanique. Cette dernière méthode s’est révélée inefficace du fait de la formation d’une couche de mousse persistante entre la surface du liquide et la turbine du briseur de mousse. Des analyses en cytométrie en flux ont permis d’observer un phénomène de dimorphisme qui semble lié au passage des cellules microbiennes au travers de cette couche de mousse, ce qui diminue le rendement en lipase. L’ajout d’antimousse chimique a donc été retenu et le transfert d’oxygène a pu être optimisé en fonction de contraintes de formation de mousse en considérant un enrichissement progressif de l’air d’entrée en oxygène pur. La dernière partie du travail a consisté à estimer l’extrapolation du procédé en prenant en compte à la fois les contraintes physico-chimiques du système (optimisation du transfert d’oxygène et limitation de la formation de mousse), ainsi que les contraintes biologiques. Cette extrapolation a tout d’abord été estimée au niveau de réacteurs scale-down permettant de reproduire les défauts d’écoulement généralement rencontrés au niveau industriel. De manière surprenante, cette étude a démontré que suite à l’adaptation physiologique des micro-organismes aux conditions d’écoulement, les problèmes de formation de mousse étaient de moins en moins marqués au cours de la montée en échelle du procédé. Cette observation va à l’encontre des calculs du génie chimique qui prédisent une augmentation du volume de mousse généré suite à la montée en volume des bioréacteurs et a été validée au niveau d’un bioréacteur pilote de 500L. Cela nous mène à conclure que la présence d’hétérogénéités au sein du volume réactionnel ne doit pas forcément être considérée comme un facteur négatif et pourrait au contraire être exploitée afin d’améliorer les performances des procédés et le design des bioréacteurs.
http://hdl.handle.net/2268/110832

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