Reference : Definition of quality standards applicable to the purification and the expansion of mes...
Dissertations and theses : Master of advanced studies dissertation
Human health sciences : Hematology
http://hdl.handle.net/2268/11058
Definition of quality standards applicable to the purification and the expansion of mesenchymal stem cells for their use in haematopoietic, immunosuppressive and regenerative cellular therapy
English
[fr] Définition des critères de qualité applicables à la purification et à l’expansion de cellules souches mésenchymateuses en vue de leur utilisation en thérapie cellulaire hématopoïétique, immunosuppressive et régénérative
Briquet, Alexandra mailto [Université de Liège - ULg > > GIGA-R : Hématologie >]
2005
Université de Liège, ​Liège, ​​Belgique
DEA en sciences biomédicales et pharmaceutiques
Gothot, André mailto
Beguin, Yves mailto
Nusgens, Betty mailto
Geenen, Vincent mailto
Noël, Agnès mailto
Rogister, Bernard mailto
[fr] Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) résident dans le compartiment stromal de la moelle osseuse et représentent un type cellulaire versatile dont les propriétés pro-hématopoïétique, immunosuppressive et régénératrice restent mal caractérisées. Une caractérisation des préparations de MSCs a été effectuée à chaque passage dans les milieux d’expansion MSCGM et α-MEM + 20% FBS. Nous avons obtenu trois fois plus des cellules après cinq passages dans le MSCGM que dans l’ α-MEM + 20% FBS. Nous avons analysé le phénotype des MSCs après chaque passage par cytométrie en flux. A chaque passage et dans les deux milieux, les cellules sont négatives pour le CD45, fortement positives pour les antigènes CD73 et CD90 et faiblement positives pour les antigènes CD105 et CD106. Nous voulions évaluer la capacité des MSCs à se différencier en adipocytes, ostéoblastes et chondroblastes. A chaque passage testé et dans les deux milieux, les MSCs se sont différenciées dans ces trois tissus lorsqu’elles ont été placées dans des milieux de différenciation adéquats. Nous avons utilisé des RayBio® Human Cytokine Antibody Array pour analyser la présence de plusieurs cytokines dans le milieu conditionné par les MSCs. A chaque passage et dans les deux milieux, IL-6, IL-8 et VCAM-1 sont plus fortement exprimés que les autres cytokines. Nous avons utilisé le CFU-F assay pour évaluer la fréquence et la pureté des MSCs en culture. Nous avons observé que le nombre de CFU-F atteint un maximum au passage 3 et 4 après expansion dans le MSCGM et l’α-MEM + 20% FBS. Nous avons observé une plus grande proportion de CFU-F pour les cellules amplifiées dans le MSCGM comparé aux cellules amplifiées dans l’α-MEM + 20% FBS. Des cultures à long terme ont été effectuées pour analyser la capacité des MSCs à favoriser l’hématopoïèse in vitro. Nous avons observé une population plus importante de colonies hématopoïétiques lorsque les cultures à long terme sont effectuées avec des MSCs de 1er ou 2ème passages que lorsque les cultures sont effectuées avec des MSCs de 3ème, 4ème et 5ème passages. A des souris NOD/SCID, nous avons greffé des cellules CD34+ non cultivées ou le produit d’expansion des cellules CD34+ cultivées pendant une semaine avec des MSCs. Le chimérisme humain était présent dans chaque condition. Nous avons observé un chimérisme plus important quand les cellules CD34+ sont cultivées avec des MSCs du passage 4 par rapport aux passages antérieurs. Dans toutes les conditions, l’expression simultanée des antigènes CD19 ou CD33 sur les cellules humaines CD45+ démontre la présence de cellules repopulatrices avec un potentiel lympho-myéloïde. En conclusion, bien que les MSCs ont le même phénotype, le même potentiel de différenciation et le même profil sécrétoire à chaque passage et dans les deux milieux, les MSCs n’ont ni la même capacité à former des CFU-F, ni la même capacité à soutenir l’hématopoïèse in vitro ou in vivo.
[en] Mesenchymal stem cells (MSCs) reside within the stromal compartment of bone marrow and represent a plastic cell population for which pro-haematopoietic, immunosuppressive and regenerative properties are poorly characterized. A characterization of MSC preparations was carried out with each passage in MSCGM or α-MEM + 20% FBS expansion media.
We obtained 3 times more cells after 5 passages in MSCGM than in α-MEM + 20% FBS. We analysed the phenotype of MSCs after each passage by flow cytometry. At all passages and in both media cells were tested negative for CD45, strongly positive for CD73 and CD90 antigens and weakly positive for CD105 and CD106 antigens. We wanted to assess the MSC ability to differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondroblasts. At all tested passages and in both media, MSCs differentiated in these three tissues when they were placed in the adequate induction medium. We used RayBio® Human Cytokine Antibody Array to analyse the presence of several cytokines in MSC-conditioned medium. At all passages and in both media, IL-6, IL-8 and VCAM-1 were more strongly expressed than the other cytokines. We used the CFU-F assay to evaluate the frequency and purity of MSCs in culture. We observed that CFU-F number reached a maximum at passages 3 and 4 after expansion in both MSCGM and in α-MEM + 20% FBS. We also observed a greater proportion of CFU-F for the cells expanded in MSCGM compared to the cells expanded in α-MEM + 20% FBS. To assess the haematopoietic supporting ability of MSCs, long term cultures were performed. We observed more colony-forming cells when long-term cultures were done with 1st and 2nd passages MSCs than when cultures were done with 3rd, 4th and 5th passages MSCs. In NOD/SCID mice we transplanted CD34+ uncultured cells or the expansion product of CD34+ cells co-cultured for one week with MSCs. Human chimerism was present in all conditions. We observed a greater human chimerism when CD34+ cells were co-cultured with MSCs from passage 4 than in the other conditions. In all conditions simultaneous expression of CD19 or CD33 antigens on human CD45+ cells demonstrated the presence of repopulating cells with lympho-myeloid potential.
Despite the fact that MSCs had the same phenotype, differentiation potential and cytokine secretion profile at each passage and in both media, MSCs did have neither the same capacity to form CFU-F nor the same capacity to support haematopoiesis in vitro and in vivo.
Giga-Infection, Immunity and Inflammation
http://hdl.handle.net/2268/11058

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