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See detailETUDE FONCTIONNELLE DES FACTEURS D’ÉPISSAGE SR D’ARABIDOPSIS THALIANA
Stankovic, Nancy ULg

Doctoral thesis (2016)

Dans ce travail, nous avons montré que la protéine RSZ22, est une protéine hautement dynamique. Cette protéine fait partie de la sous-famille des protéines RSZ d’Arabidopsis et est l’homologue de la ... [more ▼]

Dans ce travail, nous avons montré que la protéine RSZ22, est une protéine hautement dynamique. Cette protéine fait partie de la sous-famille des protéines RSZ d’Arabidopsis et est l’homologue de la protéine SRSF7 humaine. Elle possède un domaine RRM, un domaine RS et entre les deux un domaine de liaison au RNA Zn-knuckle de type CCHC. L’utilisation des approches de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et de FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) ont permis d’étudier la dynamique de cette protéine mais aussi sa capacité de navette entre le noyau et le cytoplasme comme son homologue humain SRSF7. Ces études ont été réalisées avec RSZ22 fusionnée à la GFP et surexprimée transitoirement dans des cellules foliaires mais aussi en transformation stable chez Arabidopsis (Rausin et al., 2010; Tillemans et al., 2006). Dans cette étude, nous avons montré que RSZ22, comme les protéines de la famille SR, est une protéine navette. Par analyses de FLIP-shuttling nous avons pu établir des cinétiques d'exportation et confirmer que les protéines SR végétales utilisent le récepteur CRM1/XPO1 comme voie d’exportation. Sa mobilité dépend du niveau de phosphorylation et de la concentration en ATP de la cellule. La complémentarité des techniques de surexpression en transformation transitoire et de l’expression stable ayant été démontrée (Rausin et al., 2010), nous nous y sommes référés pour notre étude de dynamique des protéines nucléaires. Nous avons également cherché à évaluer les rôles des domaines d’accrochage au RNA de RSZ22 dans sa localisation et sa dynamique. Par mutagenèse dirigée, nous avons modifié les acides aminés conservés connus pour jouer un rôle dans les interactions avec le RNA (Clery et al., 2008; Hargous et al., 2006; Lunde et al., 2007; Maris et al., 2005; Phelan et al., 2012). Nos résultats montrent que les domaines Zn-knuckle et RRM fonctionnels ne sont pas nécessaires à la localisation nucléaire de la protéine RSZ22, ni à sa localisation en speckles. La dynamique nucléocytoplasmique de la protéine RSZ22 n’est pas altérée par la mutation des motifs Zn-knuckle et RNP1. Cependant, les protéines mutées de RSZ22 répondent différemment aux traitements par la LMB. En effet, celles-ci ne sont plus « retenues » dans le noyau après un tel traitement et continuent d’être exportées vers le cytoplasme. Sachant que la LMB est un inhibiteur spécifique de la voie CRM1/XPO1, ce dernier récepteur est impliqué dans l’exportation des protéines SR en interaction avec le RNA (Williams et al., 2008). Dans la suite des recherches réalisées au sein du laboratoire, nous avons étudié la dynamique nucléo-cytoplasmique des protéines SR, en étudiant la sous-famille SRSF1-like. Chez Arabidopsis thaliana, cette famille se compose des protéines SR34, SR34a, SR34b et SR30 et possède deux domaines RRM et un domaine RS. Comme RSZ22, SR34 et SR34a font la navette entre le noyau et le cytoplasme. Nous formulons ainsi l’hypothèse que comme son homologue humain SRSF1, SR34 pourrait être impliquée dans l’exportation du mRNA vers le cytoplasme. Nous avons analysé les rôles des différents domaines de SR34 par mutagénèse dirigée. Nous avons montré que le domaine RS de la protéine SR34 est nécessaire pour la localisation nucléaire et la stabilité de la protéine. Les motifs de liaison au RNA sont impliqués dans l’exportation de SR34 par la voie CRM1/XPO1. Par la technique du double hybride en levure, une interaction entre SR34 et SR45 a pu être mise en évidence et confirmée par FLIM-FRET (Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy - Fluorescence Resonance Energy Transfert). L’analyse des interactions entre SR45 et les protéines SR34 mutantes montre l’importance des différents domaines de la protéine dans les interactions protéine-protéine. [less ▲]

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Peer Reviewed
See detailDynamic Distribution and Interaction of the Arabidopsis SRSF1 Subfamily Splicing Factors
Stankovic, Nancy ULg; Schloesser, Marie ULg; Joris, Marine ULg et al

in Plant Physiology (2016), 170

Serine/Arginine-rich (SR) proteins are essential nucleus-localized splicing factors. Our prior studies showed that Arabidopsis RSZ22, a homolog of the human SRSF7 SR factor, exits the nucleus through two ... [more ▼]

Serine/Arginine-rich (SR) proteins are essential nucleus-localized splicing factors. Our prior studies showed that Arabidopsis RSZ22, a homolog of the human SRSF7 SR factor, exits the nucleus through two pathways, either dependent or independent on the XPO1 receptor. Here, we examined the expression profiles and shuttling dynamics of the Arabidopsis SRSF1 subfamily (SR30, SR34, SR34a and SR34b) under control of their endogenous promoter in Arabidopsis and in transient expression assay. Due to its rapid nucleocytoplasmic shuttling and high expression level in transient assay, we analysed the multiple determinants that regulate the localisation and shuttling dynamics of SR34. By site-directed mutagenesis of SR34 RNA-binding sequences and RS domain, we further show that functional RRM1 or RRM2 are dispensable for the exclusive protein nuclear localization and speckle-like distribution. However, mutations of both RRMs induced aggregation of the protein whereas mutation in the RS domain decreased the stability of the protein and suppressed its nuclear accumulation. Furthermore, the RNA-binding motif mutants are defective for their export through the XPO1 (CRM1/Exportin-1) receptor pathway, but retain nucleocytoplasmic mobility. We performed a yeast two hybrid screen with SR34 as bait and discovered SR45 as a new interactor. SR45 is an unusual SR splicing factor bearing two RS domains. These interactions were confirmed in planta by FLIM-FRET and BiFC and the roles of SR34 domains in protein-protein interactions were further studied. Altogether, our report extends our understanding of shuttling dynamics of Arabidopsis SR splicing factors [less ▲]

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See detailFunctional study of Arabidopsis thaliana ASF/SF2-like pre-mRNA SR splicing factors
Stankovic, Nancy ULg; Tillemans, Vinciane; Leponce, Isabelle et al

Poster (2012, July 04)

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See detailRSZ22, a dynamic nucleocytoplasmic shuttling SR splicing factor
Tillemans, Vinciane ULg; Rausin, Glwadys; Stankovic, Nancy ULg et al

Poster (2011, March)

Detailed reference viewed: 40 (15 ULg)
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Peer Reviewed
See detailDynamic Nucleocytoplasmic Shuttling of an Arabidopsis SR Splicing Factor: Role of the RNA-Binding Domains
Rausin, Glwadys ULg; Tillemans, Vinciane ULg; Stankovic, Nancy ULg et al

in Plant Physiology (2010), 153

Serine/arginine-rich (SR) proteins are essential nuclear-localized splicing factors. We have investigated the dynamic subcellular distribution of the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) RSZp22 protein, a ... [more ▼]

Serine/arginine-rich (SR) proteins are essential nuclear-localized splicing factors. We have investigated the dynamic subcellular distribution of the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) RSZp22 protein, a homolog of the human 9G8 SR factor. Little is known about the determinants underlying the control of plant SR protein dynamics, and so far most studies relied on ectopic transient overexpression. Here, we provide a detailed analysis of the RSZp22 expression profile and describe its nucleocytoplasmic shuttling properties in specific cell types. Comparison of transient ectopic- and stable tissue-specific expression highlights the advantages of both approaches for nuclear protein dynamic studies. By site-directed mutagenesis of RSZp22 RNA-binding sequences, we show that functional RNA recognition motif RNP1 and zinc-knuckle are dispensable for the exclusive protein nuclear localization and speckle-like distribution. Fluorescence resonance energy transfer imaging also revealed that these motifs are implicated in RSZp22 molecular interactions. Furthermore, the RNA-binding motif mutants are defective for their export through the CRM1/XPO1/Exportin-1 receptor pathway but retain nucleocytoplasmic mobility. Moreover, our data suggest that CRM1 is a putative export receptor for mRNPs in plants. [less ▲]

Detailed reference viewed: 78 (36 ULg)
See detailFunctional study of Arabidopsis thaliana ASF/SF2-like pre-mRNA SR splicing factors
Stankovic, Nancy ULg; Tillemans, Vinciane; Hanikenne, Marc et al

Poster (2010, January 26)

Detailed reference viewed: 20 (7 ULg)