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See detailCaractérisation structurale des protéines et de complexes non covalents par "footprinting" et MALDI In-Source Decay
Lemaire, Pascale ULg

Doctoral thesis (2013)

La fragmentation de protéines entières dans la source d’un spectromètre de masse (« In-Source Decay » ou « ISD ») lors de l’ionisation-désorption laser assistée par une matrice (« Matrix-Assisted Laser ... [more ▼]

La fragmentation de protéines entières dans la source d’un spectromètre de masse (« In-Source Decay » ou « ISD ») lors de l’ionisation-désorption laser assistée par une matrice (« Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation » ou « MALDI ») permet leur identification. On parle alors de méthode « Top-down », par opposition à l’approche « Bottom-up » dans laquelle les protéines sont d’abord digérées en peptides. Cette fragmentation étant rapide, elle peut être considérée comme une technique intéressante pour analyser les régions d’une protéine qui sont accessibles au solvant dans des expériences qualifiées de « footprinting ». En effet, les zones non accessibles soit en raison de la conformation d’une protéine soit suite à son interaction avec un ligand seront protégées. En plus d’être rapide, la fragmentation par MALDI-ISD ne nécessite qu’une faible quantité d’échantillon. Les spectres de masse obtenus sont principalement composés d’ions fragments monochargés résultant de la rupture de la liaison peptidique, ce qui permet leur interprétation en termes de séquence. Cette technique peut donc être intégrée dans une stratégie permettant d’obtenir rapidement des données qualitatives concernant la topologie d’une protéine. Dans ce manuscrit, la fragmentation par MALDI-ISD a été utilisée pour localiser les sites qui sont accessibles au solvant et par là, les sites protégés par repliement ou par interaction de protéines avec des ligands non covalents. Les méthodes de footprinting qui utilisent des techniques de marquage oxydatif ou de marquage par le deutérium en solution ont été utilisées. La fragmentation ISD elle même peut être vue comme une méthode de footprinting directe, n’utilisant pas de marquage préalable de protéines en solution. Cette analyse repose sur l’étude des modifications d’accessibilité des groupes carbonyles en comparant le profil de fragmentation des protéines lors d’un changement structural ou lors de leur interaction avec un ligand. Footprinting oxydatif analysé par MALDI-In-Source Decay. N’ayant jamais été exploitée pour l’analyse des données de footprinting oxydatif, la fragmentation par MALDI-ISD a été utilisée pour localiser les sites d’oxydation du peptide amyloïde Aβ(1-40). Une étude de la faisabilité de détection de produits d’oxydation ainsi que l’identification des chaînes latérales oxydées a tout d’abord été effectuée en oxydant le peptide Aβ(1-40) dans une solution de peroxyde d’hydrogène. La modification des profils de fragmentation ISD du peptide oxydéa été expliquée par la probabilité d’intervention de compétitions de réactions d’addition radicalaire et de transfert de charge. Cet effet sur l’aspect global des spectres de masse n’affecte cependant que le rendement des oxydations et non leur localisation. L’oxydation du peptide Aβ(1-40) résultant de son interaction spécifique avec le fer a permis de valider l’utilisation de la méthode pour la localisation des sites d’oxydation. Une corrélation entre l’identité des résidus oxydés et les données d’interaction du métal fournies par la littérature a pu être établie. Le peptide Aβ(1-40) constitue une cible thérapeutique potentielle étant donné son implication dans la toxicité cellulaire observée dans la maladie d’Alzheimer. Les sites d’interaction de molécules bi-aromatiques susceptibles d’inhiber potentiellement l’agrégation du peptide devaient au départ être identifiés par la méthode d’échange hydrogène/deutérium (« hydrogen/deuterium exchange » ou « HDX ») analysé par MALDI-ISD. Les premières expériences ont cependant révélé que les fonctions amides du peptide étaient caractérisées par des cinétiques d’échange isotopique intrinsèques rapides. Le marquage oxydatif par des radicaux hydroxyles produits par photolyse laser du peroxyde d’hydrogène a été la stratégie alternative de choix pour l’étude d’interaction du peptide avec un ligand bi-aromatique leader. Une diminution de la proportion de la forme mono-oxydée du peptide en présence du ligand est observée sur les spectres de masse MALDI. L’identité de l’acide aminé oxydé n’a malheureusement pas été élucidée, cependant, la méthionine 35 pourrait être l’acide aminé oxydé. Footprinting utilisant le deutérium analysé par MALDI-In-Source Decay. La matrice MALDI 1,5-DAN qui est pourtant connue pour présenter un potentiel réducteur élevé, favorisant la production d’ions fragments par MALDI-ISD, n’a cependant jamais été utilisée pour l’analyse des données d’échange H/D de protéines. Les cinétiques d’échange H/D intrinsèques rapides du peptide Aβ(1-40) ont permis de l’utiliser comme modèle pour évaluer l’utilisation de la matrice 1,5-DAN pour le couplage de l’échange H/D à la spectrométrie de masse MALDI. L’homogénéité des profils d’échange isotopique et le degré de rétroéchange moyen observé sur un spot MALDI ont été examinés en comparant les résultats obtenus avec la matrice 1,5-DAN à ceux obtenus avec trois matrices MALDI plus communes. Les résultats révèlent qu’outre son potentiel réducteur élevé, la matrice 1,5-DAN possède une cinétique de cristallisation très rapide. Ceparamètre facilite la mise au point de protocoles robustes. La matrice 1,5-DAN a été utilisée pour l’analyse des données d’échange H/D de la structure tertiaire de l’ubiquitine dans des conditions natives. Les résultats obtenus en ISD sont en accord avec des données préalablement obtenues en ETD et RMN. Cet accord entre les résultats a permis de valider la méthode proposée. Une seconde étude basée sur la caractérisation de structures secondaires a été effectuée avec la β- endorphine. Les profils d’échange H/D de la β-endorphine sous une structure secondaire hélicoïdale, induite par le méthanol, ont été comparés à ceux obtenus lorsque le peptide est sous une conformation en pelote statistique non périodique. Le peptide sous sa conformation hélicoïdale présente systématiquement une accessibilité au solvant plus réduite. Les résultats obtenus sont en accord avec les prédictions qualitatives, sur base de la polarité des acides aminés, de formation d’hélices α induite par le méthanol. Footprinting utilisant la voie de fragmentation radicalaire en MALDI-In- Source Decay. Les résultats de marquage oxydatif du peptide Aβ(1-40) analysé par MALDI-ISD ont révélé une variation considérable de l’intensité relative de signaux ioniques caractéristiques d’une fragmentation induite par les radicaux hydrogènes de la matrice. Le profil de fragmentation est modifié au niveau de l’ion fragment caractérisant la tyrosine 10 du peptide. Ce résidu, selon la littérature, est impliqué dans l’interaction du peptide avec le fer. Nous avons donc évalué l’utilisation de la fragmentation ISD comme méthode de footprinting reposant sur l’étude de l’accessibilité des groupes carbonyles des protéines aux radicaux hydrogènes de matrice. Une comparaison des spectres de fragmentation ISD du lysozyme humain natif ou dénaturé puis alkylé en solution a été réalisée. Les profils de fragmentation ISD des deux conformères du lysozyme sont différents. En particulier, les ions fragments c18, c19 et z14 ont fourni une information pertinente sur la différence d’accessibilité des deux conformères visà- vis des radicaux hydrogènes. Cependant, la différence d’intensité de l’ion fragment z14 observée entre les deux conformères peut aussi être expliquée par un effet de l’alkylation de la cystéine 116 du lysozyme sur le clivage du lien N—Cα du côté C-terminal du résidu. Une étude supplémentaire a été réalisée avec un complexe formé entre le lysozyme humain et un fragment d’anticorps de camélidé, cAb-HuL6. L’objectif était de détecter une modification éventuelle du profil de fragmentation ISD lors de la complexation du lysozyme. Les intensitésrelatives des ions fragments caractérisant des acides aminés de l’interface du complexe lysozyme—cAb-HuL6 sont peu modifiées par rapport à celles du complexe Aβ(1-40)—Fe. Cette observation a conduit la conclusion que l’utilisation de la fragmentation ISD comme méthode de footprinting dépend non seulement de la stabilité du complexe (constante d’affinité, Kaff, et constante de vitesse de dissociation, kd) et des conditions expérimentales utilisées (solvant, additifs et matrice), mais aussi du type d’interactions impliquées dans la formation du complexe. [less ▲]

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Peer Reviewed
See detailIdentification and quantification of concentration-dependent biomarkers in MCF-7/BOS cells exposed to 17β-estradiol by 2-D DIGE and label-free proteomics
Collodoro, Mike ULg; Lemaire, Pascale ULg; Eppe, Gauthier ULg et al

in Journal of Proteomics (2012), in press

This paper reports the identification of biomarkers resulting from the exposure of MCF-7/BOS cells to 17β-estradiol (E2). The biomarkers were identified using 2 independent and complementary techniques, 2 ... [more ▼]

This paper reports the identification of biomarkers resulting from the exposure of MCF-7/BOS cells to 17β-estradiol (E2). The biomarkers were identified using 2 independent and complementary techniques, 2-D DIGE / MALDI-TOF peptide mass fingerprint, and 2-D UPLC-ESI MS/MS. These markers form a preliminary molecular signature that can be used when testing the estrogenic activity of xenobiotics, either pure or in mixtures. [less ▲]

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Peer Reviewed
See detailIdentification of biomarkers to estrogen exposure using MCF-7/BOS cell line exposed to 17β-estradiol and phytoestrogens
Collodoro, Mike ULg; Bertrand, Virginie ULg; Lemaire, Pascale ULg et al

Poster (2009, June)

Use of an estrogen responsive cell line and proteomic for biomarker discovery and the screening of xenoestrogen

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See detailGlobal strategy for the development of estrogenic compounds detection screening test
Collodoro, Mike ULg; Makasinga, Elu; Lemaire, Pascale ULg et al

Poster (2007, May)

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