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See detailÉvaluation de l’impact de l’extrapolation de bioréacteur sur la physiologie de Yarrowia lipolytica pour la production de lipase
Kar, Tambi ULg

Doctoral thesis (2012)

Les travaux entrepris au cours de cette thèse visent à mettre en place une méthodologie globale d’extrapolation de bioréacteurs. Le procédé de production de lipase par Yarrowia lipolytica a été plus ... [more ▼]

Les travaux entrepris au cours de cette thèse visent à mettre en place une méthodologie globale d’extrapolation de bioréacteurs. Le procédé de production de lipase par Yarrowia lipolytica a été plus particulièrement investigué, compte tenu de la complexité du système biologique et des paramètres physico-chimiques mis en œuvre. En effet, ce procédé met en œuvre une levure dite non conventionnelle dans un réacteur multiphasique G-L-L comprenant un substrat hydrophobe (le méthyloléate étant utilisé comme source de carbone renouvelable). Du fait du caractère strictement aérobie de ce type de levure, le transfert d’oxygène est un paramètre critique pour ce procédé. Dans un premier temps, l’ensemble des paramètres physico-chimiques clés du procédé ont été investigués (c’est-à-dire la dispersion du méthyloléate, les fluctuations en oxygène dissous et en pH). Cette évaluation a été menée en se basant sur des paramètres physico-chimiques (mélange du réacteur, transfert d’oxygène,…), mais également sur base de paramètres biologiques (synthèse et excrétion de la lipase, activation du gène lip2,…). Cette première étude a démontré que le paramètre critique était la fluctuation de l’oxygène dissous, ce paramètre menant à une réduction du rendement spécifique en lipase, liée à une atténuation de l’activité du gène lip2 codant pour la lipase extracellulaire de Y. lipolytica. Ce paramètre est d’autant plus important que les amplitudes des fluctuations en oxygène dissous sont amplifiées lors du processus de montée en échelle pour l’extrapolation du procédé. L’efficacité de dispersion du substrat hydrophobe (méthyloléate) au sein du milieu aqueux ne semble pas avoir d’impact sur l’efficacité du procédé, la levure sécrétant un biosurfactant permettant de stabiliser la dispersion. Les fluctuations en pH ont également peu d’impact sur le rendement de production de lipase, mais des observations au microscope ont révélé un début de dimorphisme cellulaire. Cette observation démontre la complexité de la réponse du système biologique face aux conditions de procédé. L’impact des fluctuations en oxygène dissous sur l’activité du gène lip2 a été confirmé par des analyses plus poussées en PCR quantitative (RT-qPCR). La deuxième partie du travail a donc été focalisée sur l’optimisation du transfert d’oxygène. Cette optimisation n’est pas triviale si on considère le phénomène de formation de mousse important lorsque la dispersion G-L au sein du réacteur est trop fine. Deux stratégies antimousse ont donc été envisagées : l’une mettant en œuvre l’ajout d’antimousse chimique et l’autre l’emploi d’un briseur de mousse mécanique. Cette dernière méthode s’est révélée inefficace du fait de la formation d’une couche de mousse persistante entre la surface du liquide et la turbine du briseur de mousse. Des analyses en cytométrie en flux ont permis d’observer un phénomène de dimorphisme qui semble lié au passage des cellules microbiennes au travers de cette couche de mousse, ce qui diminue le rendement en lipase. L’ajout d’antimousse chimique a donc été retenu et le transfert d’oxygène a pu être optimisé en fonction de contraintes de formation de mousse en considérant un enrichissement progressif de l’air d’entrée en oxygène pur. La dernière partie du travail a consisté à estimer l’extrapolation du procédé en prenant en compte à la fois les contraintes physico-chimiques du système (optimisation du transfert d’oxygène et limitation de la formation de mousse), ainsi que les contraintes biologiques. Cette extrapolation a tout d’abord été estimée au niveau de réacteurs scale-down permettant de reproduire les défauts d’écoulement généralement rencontrés au niveau industriel. De manière surprenante, cette étude a démontré que suite à l’adaptation physiologique des micro-organismes aux conditions d’écoulement, les problèmes de formation de mousse étaient de moins en moins marqués au cours de la montée en échelle du procédé. Cette observation va à l’encontre des calculs du génie chimique qui prédisent une augmentation du volume de mousse généré suite à la montée en volume des bioréacteurs et a été validée au niveau d’un bioréacteur pilote de 500L. Cela nous mène à conclure que la présence d’hétérogénéités au sein du volume réactionnel ne doit pas forcément être considérée comme un facteur négatif et pourrait au contraire être exploitée afin d’améliorer les performances des procédés et le design des bioréacteurs. [less ▲]

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See detailPhysical and physiological impacts of different foam control strategies during a process involving hydrophobic substrate for the lipase production by Yarrowia lipolytica
Kar, Tambi ULg; Destain, Jacqueline ULg; Thonart, Philippe ULg et al

in Bioprocess and Biosystems Engineering (2012), 35(4), 483-492

The potentialities for the intensification of the process of lipase production by the yeast Yarrowia lipolytica on a renewable hydrophobic substrate (methyloleate) have been investigated. The key factor ... [more ▼]

The potentialities for the intensification of the process of lipase production by the yeast Yarrowia lipolytica on a renewable hydrophobic substrate (methyloleate) have been investigated. The key factor governing the lipase yield is the intensification of the oxygen transfer rate, considering the fact that Y. lipolytica is a strict aerobe. However, considering the nature of the substrate and the capacity for protein excretion and biosurfactant production of Y. lipolytica, intensification of oxygen transfer rate is accompanied by an excessive formation of foam. Two different foam control strategies have thus been implemented: a classical chemical foam control strategy (CFM) and a mechanical foam control (MFM) based on the Stirring As Foam Disruption (SAFD) principle. The second strategy allows foam control without any modifications of the physico-chemical properties of the broth. However, the MFM system design induced the formation of a persistent foam layer in the bioreactor. This phenomenon has led to the segregation of microbial cells between the foam phase and the liquid phase in the case of the bioreactors operated with MFM control, and induced a reduction at the level of the lipase yield. More interestingly, flow cytometry experiments have shown that residence time of microbial cells in the foam phase tends to induce a dimorphic transition which could potentially explain the reduction of lipase excretion. [less ▲]

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Peer Reviewed
See detailDimensionnement et extrapolation des bioréacteurs sur base de paramètres physiologiques : cas de la production de lipase par Yarrowia lipolytica
Kar, Tambi ULg; Delvigne, Frank ULg; Destain, Jacqueline ULg et al

in Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement = Biotechnology, Agronomy, Society and Environment [=BASE] (2011), 15(4), 585-595

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See detailL'extrapolation des bioréacteurs : un problème de génie des procédés ou de physiologie microbienne ?
Delvigne, Frank ULg; Destain, Jacqueline ULg; Brognaux, Alison ULg et al

in Chimie Nouvelle (2010), 104

Bioreactor scale-up often pose a serious issue during the industrial development of a bioprocess considering the numerous physical and biological phenomena occurring in the reacting volume. The basic ... [more ▼]

Bioreactor scale-up often pose a serious issue during the industrial development of a bioprocess considering the numerous physical and biological phenomena occurring in the reacting volume. The basic principles of scale-up coming from the traditional chemical and process engineering approaches will be first reviewed and will be then compared to a new one involving recent development at the level of microbial strain manipulation. This "physiological" approach of scale-up involves directly a biological component of the system (by comparison with the traditional approach for scaling-up involving physical parameters indirectly linked to the physiological phenomena occurring in the bioreactor), i.e. the synthesis of a reporter fluorescent protein when microbial cells are exposed to stress. It will be shown how this principle can be used for a better understanding of the relationship between bioreactor hydrodynamics and microbial stress. [less ▲]

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Peer Reviewed
See detailImpact of scaled-down dissolved oxygen fluctuations at different levels of the lipase synthesis pathway of Yarrowia lipolytica
Kar, Tambi ULg; Destain, Jacqueline ULg; Thonart, Philippe ULg et al

in Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement = Biotechnology, Agronomy, Society and Environment [=BASE] (2010), 14

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Peer Reviewed
See detailInvestigation of the effect of different extracellular factors on the lipase production by Yarrowia lipolityca on the basis of a scale-down approach
Kar, Tambi ULg; Delvigne, Frank ULg; Masson et al

in JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY (2008), 35(9), 1053-1059

The influence of three extracellular factors (namely, the methyl oleate dispersion in the broth, the dissolved oxygen variations, and the pH fluctuation) on the lipase production by Y. lipolytica in batch ... [more ▼]

The influence of three extracellular factors (namely, the methyl oleate dispersion in the broth, the dissolved oxygen variations, and the pH fluctuation) on the lipase production by Y. lipolytica in batch bioreactor has been investigated in different scale-down apparatus. These systems allow to reproduce the hydrodynamic phenomena encountered in large-scale equipments for the three specified factors. The effects of the extracellular factors have been observed at three distinct levels: the microbial growth, the extracellular lipase production, and the induction of the gene LIP2 encoding for the main lipase of Y. lipolytica. Among the set of environmental factors investigated, the dissolved oxygen fluctuations generated in a controlled scale-down reactor (C-SDR) have led to the more pronounced physiological effect by decreasing the LIP2 gene expression level. The other environmental factors observed in a partitioned scale-down reactor, i.e., the methyl oleate dispersion and the pH fluctuations, have led to a less severe stress traduced only by a decrease of the microbial yield and thus of the extracellular lipase specific production rate. [less ▲]

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