EFFECT OF MYELOPEROXIDASE ON MITOCHONDRIAL RESPIRATORY FUNCTION OF PERMEABILIZED PRIMARY EQUINE SKELETAL MYOBLASTS IN CULTURE.

Poster (2012, November)

Possible intracellular effect of the new water-soluble form of curcumin (NDS27) on the oxidant response of stimulated neutrophils

Poster (2012, April 18)

Neutrophils (PMNs) are involved in host defense against infections through the production of reactive oxygen species (ROS) to kill pathologic agents. But, an excessive ROS production, called “oxidative ... [more ▼]

Neutrophils (PMNs) are involved in host defense against infections through the production of reactive oxygen species (ROS) to kill pathologic agents. But, an excessive ROS production, called “oxidative stress” is associated with tissue damages and development of chronic or acute inflammatory diseases. PMNs are prime therapeutic targets to control inflammatory events associated to ROS production. Nowadays, there is a growing interest for the use of polyphenolic molecules to modulate the inflammatory response. The aim of this work was to study the antioxidant effect of NDS27 (1), a new highly water-soluble form of the polyphenolic molecule curcumin, on in vitro stimulated equine PMNs. NDS27 (10-6 to 10-4 M) was pre-incubated with cells and eliminated before their activation. The ability of NDS27 to enter into the cells was checked by HPLC from the cellular extracts. The intracellular ROS production by phorbol myristate acetate (PMA) stimulated PMNs was measured by fluorescence using 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate. Lucigenin dependent chemiluminescence was used to measure extracellular ROS production. Additionally, the effect of NDS27 was tested on the activity of myeloperoxidase (MPO), a hemic enzyme contributing to the oxidant response of neutrophils. The activity of the released MPO by cytochalazine B (CB) and N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) stimulated PMNs was measured by SIEFED (“Specific Immunologic Extraction Followed by Enzymatic Detection”) (2). The HPLC results showed that NDS27 enters into PMNs and interacts with their membrane. NDS27 significantly and dose-dependently inhibited the ROS production in neutrophils without affecting their viability. Likewise, the activity of MPO released by PMNs was lowered by NDS27. Overall, our findings demonstrate that the membrane of neutrophils is permeable to NDS27 or interacts with the drug, suggesting that its inhibitory effect on ROS production is mainly associated to an intracellular effect probably by acting on the enzymes implied in respiratory burst like NADPH oxidase and MPO. The modulatory effect of NDS27 towards the oxidant activity of cells involved in immune and inflammatory response open therapeutic perspectives to control equine or human pathologies with excessive inflammatory reactions. 1. Neven et al. 2011, Patent Application Publication: US2011/0257126 A1 2. Serteyn et al. 2005, European Patent Specification : EP1711817 B1 [less ▲]

Activité et modulation de la NADPH oxydase des neutrophiles équins: tests in vitro sur cellules entières et mise au point du dosage en "cell-free system"

Master's dissertation (2011)

Chez le cheval, la réponse inflammatoire causée par certaines pathologies (obstruction intestinale, fourbure,…) implique une stimulation excessive des polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) libérant de ... [more ▼]

Chez le cheval, la réponse inflammatoire causée par certaines pathologies (obstruction intestinale, fourbure,…) implique une stimulation excessive des polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) libérant de grandes quantités d’espèces activées de l’azote et de l’oxygène (RNOS). La première enzyme impliquée dans la formation de ces espèces activées est la NADPH oxydase, produisant l’anion superoxyde (O2.-) d’où dérivera la formation de diverses RNOS. Actuellement, la NADPH oxydase est considérée comme une cible privilégiée pour la modulation de l’inflammation excessive. Le but de ce travail a été d’étudier l’effet de molécules modulant la réponse inflammatoire (la curcumine, la quercétine et l’acépromazine : ACP) ou l’activité de la NADPH oxydase (le diphénylène iodonium : DPI) sur la production de RNOS par les PMNs stimulés. L’étude a été menée sur des PMNs équins isolés où la production de RNOS a été mise en évidence par trois techniques différentes : la chimiluminescence assistée par la lucigénine et la réduction du ferricytochrome C, ciblant essentiellement la production d’O2.- ; et une technique de fluorescence utilisant la 2’,7’-dichlorofluorescine-diacétate (DCFH-DA), ciblant la production intra et extracellulaire de RNOS. L’effet de ces molécules a pu être testé de façon plus spécifique sur la NADPH oxydase par une mesure en « cell-free system » que nous avons mise au point et consistant en la reconstitution in vitro de la NADPH oxydase. Nous avons constaté que les molécules polyphénoliques testées (quercétine et curcumine) agissaient surtout comme des antioxydants stoechiométriques en neutralisant les RNOS intracellulaires et extracellulaires sans pour autant être des inhibiteurs de la NADPH oxydase. Nous avons également démontré que certaines molécules (l’ACP et le DPI) utilisées à forte concentration pouvaient amplifier la réponse oxydante des PMNs. Enfin, grâce à la technique du « cell free system » nous avons démontré, pour la première fois, l’effet anti-catalytique du DPI sur la NADPH oxydase équine. La complémentarité de ces techniques permettra de faire la distinction entre un effet antioxydant, pro-oxydant ou anti-catalytique d’une molécule biologique pouvant moduler la réponse inflammatoire. Enfin, ce travail présente les premiers résultats de l’isolement des sous-unités membranaires de la NADPH oxydase équine. Les résultats sont encourageants et la purification à plus long terme du complexe enzymatique entier avec la production d’anticorps spécifiques devrait permettre la mise au point d’un dosage original de la NADPH oxydase consistant en l’immuno-capture de l’enzyme active afin de cibler l’effet de substances biologiques sur son assemblage et son activité spécifique. [less ▲]